雌二醇通過Wnt信號(hào)通路調(diào)節(jié)大鼠BMSCs成骨分化機(jī)制研究.pdf

1、目的：觀察不同濃度17β-雌二醇對(duì)大鼠BMSCs成骨分化的影響，并分析成骨分化過程中經(jīng)典Wnt信號(hào)通路相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的表達(dá)差異，探索17β-雌二醇通過Wnt/β-catenin信號(hào)通路調(diào)節(jié)大鼠BMSCs成骨分化的作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用雌激素或SERMs治療PMOP提供理論依據(jù)。
　　方法：應(yīng)用全骨髓培養(yǎng)法分離4周齡雄性SD大鼠雙下肢的骨髓單個(gè)核細(xì)胞，通過多次換液及傳代時(shí)控制胰酶消化時(shí)間純化 BMSCs；利用 BMSCs的三個(gè)特性對(duì)

2、其進(jìn)行鑒定，①貼壁特性；②多向分化潛能：對(duì)P2代細(xì)胞分別進(jìn)行成骨、成脂誘導(dǎo)并設(shè)空白對(duì)照，每3天全量換液，于成骨誘導(dǎo)第7天進(jìn)行ALP染色，成骨誘導(dǎo)第21天進(jìn)行Alizarin Red S染色，成脂誘導(dǎo)14天進(jìn)行Oil Red O染色，觀察其分化能力；③利用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞表面標(biāo)志物進(jìn)行檢測：CD34、CD44、CD45、CD105。將鑒定成功的大鼠BMSCs接種于多個(gè)6孔板中，進(jìn)行分組培養(yǎng)，分別為0、10-5、10-6、10-7、10-8

3、、10-9 mol/L組，待每孔細(xì)胞達(dá)到約80％融合，以相應(yīng)梯度濃度17β-雌二醇處理各組細(xì)胞，DMSO處理作為對(duì)照組，同時(shí)對(duì)各組進(jìn)行成骨誘導(dǎo)，每3天全量換液，于成骨誘導(dǎo)第7天進(jìn)行ALP染色并進(jìn)行ALP定量分析，成骨誘導(dǎo)第7天分別提取各組細(xì)胞總蛋白，利用Western blot檢測各組細(xì)胞Wnt10b、β-catenin、LRP5表達(dá)量，成骨誘導(dǎo)第21天進(jìn)行Alizarin Red S染色。
　　結(jié)果：利用全骨髓培養(yǎng)法分離出的大鼠

4、骨髓中的單個(gè)核細(xì)胞形態(tài)良好，增殖能力強(qiáng)；通過多次換液及傳代時(shí)控制胰酶消化時(shí)間可純化BMSCs，P2代細(xì)胞純度可達(dá)95%；對(duì)P2代細(xì)胞分別進(jìn)行成骨誘導(dǎo)和成脂誘導(dǎo)，經(jīng)鑒定BMSCs可向成骨細(xì)胞及脂肪細(xì)胞分化；利用流式細(xì)胞術(shù)鑒定P2代細(xì)胞，證實(shí)所得細(xì)胞為間充質(zhì)來源且均一性較高；對(duì) P2代細(xì)胞進(jìn)行成骨誘導(dǎo)的同時(shí)用梯度濃度（0、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9 mol/L）的17β-雌二醇進(jìn)行處理，成骨誘導(dǎo)7天后ALP染色及定量分

5、析顯示，隨著17β-雌二醇濃度的增加，ALP表達(dá)量逐漸增加，且活性增強(qiáng)，其中10-5 mol/L組活性最強(qiáng)，各處理組與空白對(duì)照組比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；成骨誘導(dǎo)第7天，對(duì)各組目標(biāo)蛋白表達(dá)量進(jìn)行Western blot檢測顯示：Wnt10b、β-catenin表達(dá)量隨著17β-雌二醇濃度的增加而逐漸增加，10-5 mol/L組最高，LRP5各組表達(dá)量無明顯差異；成骨誘導(dǎo)第21天Alizarin Red S染色結(jié)果顯示：各組紅褐色礦化結(jié)節(jié)

6、的數(shù)量亦隨著17β-雌二醇濃度的增高而逐漸增加。
　　結(jié)論：通過全骨髓培養(yǎng)法可分離篩選出純度高、均一性好、增殖能力強(qiáng)的BMSCs；BMSCs在特定的誘導(dǎo)條件下可向成骨細(xì)胞及脂肪細(xì)胞分化，具有多向分化潛能；體外成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下，雌激素可濃度依賴性的促進(jìn)大鼠BMSCs成骨分化，參與成骨細(xì)胞的分化成熟，并且此效應(yīng)可能是通過上調(diào)經(jīng)典 Wnt信號(hào)通路中Wnt10b及β-catenin的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的，而雌激素對(duì)經(jīng)典Wnt信號(hào)通路中膜受體LRP