Smad信號(hào)通路調(diào)控BMP9介導(dǎo)的iSCAP成骨-成牙本質(zhì)分化的機(jī)制研究.pdf

1、目的：課題組前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)骨形態(tài)發(fā)生蛋白9（BMP9）在誘導(dǎo)小鼠永生化根尖牙乳頭干細(xì)胞（iSCAP）向成骨/成牙本質(zhì)方向分化方面能力較強(qiáng)，但目前對(duì)于相關(guān)分子學(xué)機(jī)制的研究較少。研究發(fā)現(xiàn)，Smad信號(hào)通路屬于BMP信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)中的經(jīng)典通路。因此，本課題主要是研究BMP9是否能夠激活iSCAP細(xì)胞中的Smad信號(hào)通路，以及Smad信號(hào)通路在BMP9誘導(dǎo)iSCAP細(xì)胞成骨/成牙本質(zhì)向分化中的作用。
　　方法：首先，用Ad-BMP9轉(zhuǎn)染iSC

2、AP，36h后采用Western免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Smad1/5/8蛋白的磷酸化水平。隨后，用顯性負(fù)性突變受體 ALK1（dnALK1）重組腺病毒和 BMP9條件培養(yǎng)基共同作用于iSCAP，通過(guò)Western免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Smad1/5/8蛋白磷酸化水平；然后，分別采用堿性磷酸酶（ALP）活性檢測(cè)和染色方法分析 iSCAP早期成骨/成牙本質(zhì)指標(biāo)變化，Western印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)中晚期成骨/成牙本質(zhì)相關(guān)蛋白OCN、OPN表達(dá)，茜素紅染色法檢

3、測(cè)鈣鹽沉積程度；最后，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（RT-PCR）檢測(cè)dnALK1對(duì)BMP9誘導(dǎo)iSCAP成骨/成牙本質(zhì)相關(guān)基因Runx2、OCN、OPN和DMP1表達(dá)的影響。
　　結(jié)果：BMP9可上調(diào)iSCAP中Smad1/5/8的磷酸化水平；dnALK1競(jìng)爭(zhēng)性抑制BMP9條件培養(yǎng)基的作用后，Smad1/5/8的磷酸化水平下調(diào)，BMP9誘導(dǎo)的iSCAP細(xì)胞中早期成骨/成牙本質(zhì)標(biāo)志物堿性磷酸酶活性下降，中晚期成骨/成牙本質(zhì)相關(guān)蛋白 O

4、CN、OPN表達(dá)減少，晚期成骨/成牙本質(zhì)標(biāo)志鈣鹽結(jié)節(jié)減少。RT-PCR結(jié)果顯示重要成骨轉(zhuǎn)錄因子Runx2基因表達(dá)減少，成骨/成牙本質(zhì)相關(guān)基因OCN、OPN、DMP1的表達(dá)也受到了抑制。
　　結(jié)論：Smad信號(hào)通路在BMP9誘導(dǎo)iSCAP成骨/成牙本質(zhì)過(guò)程中存在并起著重要作用。ALK1是BMP9-Smad信號(hào)通路中的重要受體， dnALK1能有效拮抗 BMP9蛋白的活性，但是否同樣抑制其他信號(hào)通路還需要進(jìn)一步研究，后續(xù)我們將通過(guò)體內(nèi)