阿托伐他汀抑制TGF-β1誘導(dǎo)的主動脈平滑肌細胞成骨樣分化的機制研究.pdf

1、目的:
　　 血管鈣化可發(fā)生在老年，動脈粥樣硬化以及代謝性疾病中，例如糖尿病和終末期腎病。TGF-β1能夠促進血管平滑肌細胞(VSMCs)的分化和調(diào)節(jié)細胞鈣化。3-羥-3-甲基戊二酰輔酶A抑制劑（他汀類藥物）在心血管疾病中發(fā)揮出多方面的益處。β-catenin轉(zhuǎn)移至核內(nèi)參與血管鈣化過程促進特定基因的表達。自噬作為高度保守的細胞活動通過溶酶體依賴途徑調(diào)節(jié)胞質(zhì)內(nèi)蛋白更新。然而，目前關(guān)于他汀類藥物通過自噬和β-catenin信號通路對

2、平滑肌細胞成骨樣分化的影響研究尚少。
　　 有關(guān)血管鈣化的調(diào)節(jié)機制已有很多理論觀點，但是自噬活動在調(diào)控平滑肌細胞成骨樣分化中的作用和分子機制研究尚少。有學(xué)者認為作為細胞自我保護機制的自噬活動可直接促進膠原的降解，而膠原也是細胞成骨樣分化中的標志蛋白之一。因此本研究旨在研究阿托伐他汀通過誘導(dǎo)自噬和影響TGFβ1/β-catenin信號通路進而發(fā)揮抑制成骨樣分化的相關(guān)作用機制。
　　 方法:
　　 本研究從細胞分子水

3、平，考察TGFβ1對VSMCs中β-catenin表達和功能的影響以及對成骨樣分化標志性蛋白表達的影響;利用蛋白免疫印跡、實時熒光定量PCR、小干擾RNA轉(zhuǎn)染以及激光共聚焦技術(shù)探討自噬及β-catenin轉(zhuǎn)錄蛋白在TGFβ1通路誘導(dǎo)成骨樣分化中的作用及信號調(diào)節(jié)機制。而且利用相關(guān)信號通路抑制劑，自噬抑制劑進一步證實了阿托伐他汀在抑制TGF-β1誘導(dǎo)的成骨樣分化中的作用機制。旨在為阿托伐他汀在血管退行性疾病中的應(yīng)用提供新的理論依據(jù)，為退行性

4、血管病的防治提供新的靶點。
　　 結(jié)果:
　　 1、阿托伐他汀抑制TGF-β1誘導(dǎo)的平滑肌細胞的成骨樣分化
　　 結(jié)果顯示TGF-β1刺激細胞6、12、24、48、72小時，Westernblot結(jié)果證實TGF-β1可促進成骨樣分化標志蛋白如Ⅰ型膠原(typeⅠcollagen)，骨形成蛋白（BMP-2）和骨鈣素(osteocalcin)的蛋白水平表達增加并呈時間依賴性。然而，應(yīng)用阿托伐他汀預(yù)處理平滑肌細胞24小

5、時后，與單獨TGF-β1刺激組比較，鈣鹽沉積明顯減少，同樣觀察到在蛋白水平阿托伐他汀可使上述成骨樣分化標志蛋白表達明顯下降。
　　 2、阿托伐他汀通過誘導(dǎo)自噬抑制平滑肌細胞成骨樣分化
　　 2.1、在電鏡下觀察平滑肌細胞，結(jié)果顯示自噬泡在正常細胞中較少見。在TGF-β1誘導(dǎo)的平滑肌成骨樣分化的過程中有少量的自噬泡形成。而當(dāng)采用阿托伐他汀預(yù)處理平滑肌細胞24小時繼而應(yīng)用相同濃度TGF-β1，電鏡結(jié)果顯示細胞質(zhì)中出現(xiàn)大量的自

6、噬泡。應(yīng)用吖啶橙染色觀察自噬泡可以得到相同的結(jié)論。
　　 2.2、Westernblot結(jié)果顯示，阿托伐他汀可使自噬相關(guān)蛋白Beclin-1和Atg5的表達增加并呈時間依賴性。LC3Ⅱ(:)LC3Ⅰ同樣也在阿托伐他汀預(yù)處理后較TGF-β1組明顯升高。
　　 2.3、為了進一步明確自噬與成骨樣分化的關(guān)系，利用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)在自噬過程中可抑制自噬泡(AVs)的形成。研究應(yīng)用3-MA后發(fā)現(xiàn)其可明顯抑制阿托

7、伐他汀誘導(dǎo)的LC3Ⅱ(:)LC3Ⅰ增高，同時阿托伐他汀發(fā)揮出的抑制成骨樣分化的作用也在應(yīng)用3-MA后被減弱。
　　 3、阿托伐他汀通過下調(diào)β-catenin表達誘導(dǎo)平滑肌細胞自噬
　　 3.1、觀察β-catenin在阿托伐他汀抑制TGF-β1誘導(dǎo)的平滑肌細胞成骨樣分化中的作用。研究中觀察到TGF-β1不僅可以使其經(jīng)典的pSmad2/3發(fā)生核轉(zhuǎn)位，而且可使β-catenin同樣發(fā)生核轉(zhuǎn)位。Westernblot結(jié)果顯示:

8、TGF-β1可使β-catenin呈時間依賴性的增高。
　　 3.2、研究TGF-βRI及β-catenin在自噬和鈣化的作用，應(yīng)用TGF-βRI激酶抑制劑SD208或者β-catenin抑制劑JW74均明顯加重TGF-β1誘導(dǎo)自噬，但上述二者可減少TGF-β1誘導(dǎo)的平滑肌細胞成骨樣分化。以上結(jié)果說明TGF-βRI與β-catenin參與TGF-β1誘導(dǎo)的自噬和鈣化。
　　 3.3、為了進一步明確阿托伐他汀誘導(dǎo)的自噬是否

9、依賴于下調(diào)β-catenin水平，采用阿托伐他汀預(yù)處理細胞，westernblot結(jié)果顯示，阿托伐他汀可明顯降低TGF-β1誘導(dǎo)的β-catenin蛋白水平表達。為進一步明確阿托伐他汀在TGF-β1誘導(dǎo)的自噬和鈣化中的作用。利用重組蛋白Wnt3A過表達β-catenin進而增加功能性β-catenin水平。研究表明，Wnt3A明顯增加β-catenin表達，同時阿托伐他汀誘導(dǎo)的自噬可以被Wnt3A明顯抑制。而阿托伐他汀對TGF-β1誘導(dǎo)