PDGF-BB誘導(dǎo)大鼠胸主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞遷移機(jī)制的研究.pdf

1、目的:動(dòng)脈粥樣硬化是威脅人類健康的主要原因,在我國(guó)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年升高的趨勢(shì)。血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)的增殖和遷移,是形成動(dòng)脈粥樣硬化的重要因素之一。多種細(xì)胞因子對(duì)血管平滑肌細(xì)胞的遷移有明顯作用,如血管活性物質(zhì)、生長(zhǎng)因子和細(xì)胞外基質(zhì)等。血小板源性生長(zhǎng)因子(Platelet-Derived Growth Factor,PDGF)是一種重要的促細(xì)胞分裂原,它可以誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞從中膜遷移到內(nèi)膜,是引起動(dòng)脈粥樣硬化的主要因素。

2、血管平滑肌細(xì)胞的遷移涉及到促遷移信號(hào)的跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞信號(hào)分子的級(jí)聯(lián)活化及其細(xì)胞骨架蛋白的收縮和細(xì)胞變形等過(guò)程。其中PDGF是一種二硫化物的二聚體,由兩個(gè)同質(zhì)異形體A鏈和B鏈形成,有PDGF-AA、PDGF-BB和PDGF-AB三種形式。此因子在正常動(dòng)脈中不表達(dá),但在血管成型術(shù)后或者動(dòng)脈粥樣硬化引起的內(nèi)皮細(xì)胞損傷時(shí)表達(dá)量都有所增加。因此,PDGF可能作為遷移的介質(zhì)之一發(fā)揮著重要作用.其中,PDGF-BB來(lái)源于血小板、內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞,作

3、用于平滑肌細(xì)胞。具有趨化作用和刺激平滑肌細(xì)胞增殖的作用,是已知最強(qiáng)的血管平滑肌細(xì)胞體外趨化劑,可通過(guò)對(duì)細(xì)胞遷移信號(hào)通路的直接調(diào)控來(lái)控制血管平滑肌細(xì)胞的遷移,但是其相關(guān)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制尚不十分清楚。本研究旨在研究PDGF-BB在血管平滑肌細(xì)胞遷移中作用的分子機(jī)制。
　　 方法:(1)運(yùn)用劃痕實(shí)驗(yàn)方法。以不同濃度(1,5,10,20和50ng/ml)PDGF-BB為誘導(dǎo)劑,觀察24h后的細(xì)胞遷移距離,確定PDGF-BB誘導(dǎo)大鼠胸

4、主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞遷移的最佳濃度;(2)使用ROCK特異抑制劑Y27632和MLCK抑制劑ML7,觀察其對(duì)細(xì)胞遷移的影響;(3)運(yùn)用免疫熒光方法,觀察不同濃度PDGF-BB誘導(dǎo)后的F-actin和vinculin的形態(tài)學(xué)變化和加入抑制劑ML7和Y27632后F-actin和vinculin的形態(tài)學(xué)變化;(4)采用蛋白印跡技術(shù)。檢測(cè)PDGF-BB誘導(dǎo)后的ROCKⅠ,ROCKⅡ蛋白表達(dá)量和MLC磷酸化水平的變化;(5)運(yùn)用siRNA干擾技

5、術(shù),使ROCKⅠ和ROCKⅡ基因表達(dá)下調(diào),或加入抑制劑Y27632和ML7后,檢測(cè)ROCK下游分子MLC磷酸化水平的變化。
　　 結(jié)果:(1)劃痕實(shí)驗(yàn)法檢測(cè)細(xì)胞遷移:PDGF-BB誘導(dǎo)細(xì)胞遷移的最佳濃度為10ng/ml;Y27632和ML7均抑制了細(xì)胞的遷移。(2)免疫熒光實(shí)驗(yàn)進(jìn)行細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察:高濃度的PDGF-BB誘導(dǎo)細(xì)胞后,F-actin偽足明顯增多,且縱向平行排列,形成應(yīng)力纖維絲;而vinculin蛋白表達(dá)卻明顯減少,

6、且在10ng/ml時(shí)比較明顯;加入抑制劑ML7后,F-actin偽足減少,vinculin蛋白表達(dá)增多;加入抑制劑Y27632后,細(xì)胞形態(tài)發(fā)生較大改變,沒(méi)有形成F-actin的應(yīng)力纖維絲。(3)免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)蛋白水平的變化:不同濃度的PDGF-BB誘導(dǎo)后,ROCKⅠ,ROCKⅡ蛋白表達(dá)量呈濃度依賴性增加。(4)甘油膠檢測(cè)MLC磷酸化水平的變化:10ng/ml的PDGF-BB在不同時(shí)間誘導(dǎo)細(xì)胞后,MLC磷酸化水平?jīng)]有明顯的變化;ROCK