PDGF-BB誘導大鼠胸主動脈血管平滑肌細胞遷移機制的研究.pdf

1、目的:動脈粥樣硬化是威脅人類健康的主要原因,在我國動脈粥樣硬化的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年升高的趨勢。血管平滑肌細胞(VSMC)的增殖和遷移,是形成動脈粥樣硬化的重要因素之一。多種細胞因子對血管平滑肌細胞的遷移有明顯作用,如血管活性物質、生長因子和細胞外基質等。血小板源性生長因子(Platelet-Derived Growth Factor,PDGF)是一種重要的促細胞分裂原,它可以誘導血管平滑肌細胞從中膜遷移到內膜,是引起動脈粥樣硬化的主要因素。

2、血管平滑肌細胞的遷移涉及到促遷移信號的跨膜轉導、細胞信號分子的級聯(lián)活化及其細胞骨架蛋白的收縮和細胞變形等過程。其中PDGF是一種二硫化物的二聚體,由兩個同質異形體A鏈和B鏈形成,有PDGF-AA、PDGF-BB和PDGF-AB三種形式。此因子在正常動脈中不表達,但在血管成型術后或者動脈粥樣硬化引起的內皮細胞損傷時表達量都有所增加。因此,PDGF可能作為遷移的介質之一發(fā)揮著重要作用.其中,PDGF-BB來源于血小板、內皮細胞、巨噬細胞,作

3、用于平滑肌細胞。具有趨化作用和刺激平滑肌細胞增殖的作用,是已知最強的血管平滑肌細胞體外趨化劑,可通過對細胞遷移信號通路的直接調控來控制血管平滑肌細胞的遷移,但是其相關的細胞內信號轉導機制尚不十分清楚。本研究旨在研究PDGF-BB在血管平滑肌細胞遷移中作用的分子機制。
　　 方法:(1)運用劃痕實驗方法。以不同濃度(1,5,10,20和50ng/ml)PDGF-BB為誘導劑,觀察24h后的細胞遷移距離,確定PDGF-BB誘導大鼠胸

4、主動脈血管平滑肌細胞遷移的最佳濃度;(2)使用ROCK特異抑制劑Y27632和MLCK抑制劑ML7,觀察其對細胞遷移的影響;(3)運用免疫熒光方法,觀察不同濃度PDGF-BB誘導后的F-actin和vinculin的形態(tài)學變化和加入抑制劑ML7和Y27632后F-actin和vinculin的形態(tài)學變化;(4)采用蛋白印跡技術。檢測PDGF-BB誘導后的ROCKⅠ,ROCKⅡ蛋白表達量和MLC磷酸化水平的變化;(5)運用siRNA干擾技

5、術,使ROCKⅠ和ROCKⅡ基因表達下調,或加入抑制劑Y27632和ML7后,檢測ROCK下游分子MLC磷酸化水平的變化。
　　 結果:(1)劃痕實驗法檢測細胞遷移:PDGF-BB誘導細胞遷移的最佳濃度為10ng/ml;Y27632和ML7均抑制了細胞的遷移。(2)免疫熒光實驗進行細胞的形態(tài)學觀察:高濃度的PDGF-BB誘導細胞后,F-actin偽足明顯增多,且縱向平行排列,形成應力纖維絲;而vinculin蛋白表達卻明顯減少,

6、且在10ng/ml時比較明顯;加入抑制劑ML7后,F-actin偽足減少,vinculin蛋白表達增多;加入抑制劑Y27632后,細胞形態(tài)發(fā)生較大改變,沒有形成F-actin的應力纖維絲。(3)免疫印跡實驗檢測蛋白水平的變化:不同濃度的PDGF-BB誘導后,ROCKⅠ,ROCKⅡ蛋白表達量呈濃度依賴性增加。(4)甘油膠檢測MLC磷酸化水平的變化:10ng/ml的PDGF-BB在不同時間誘導細胞后,MLC磷酸化水平沒有明顯的變化;ROCK