阿托伐他汀對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的大鼠血管平滑肌細(xì)胞Cat S表達(dá)和細(xì)胞遷移的影響.pdf

1、血管損傷導(dǎo)致再狹窄時(shí)多種炎癥因子和細(xì)胞因子被激活；這些因子相互作用加重了血管壁的炎癥反應(yīng)，促進(jìn)了新生內(nèi)膜的形成。白介素-1β(IL-1β)是一種典型的促炎癥因子，可以調(diào)控其它炎癥因子和生長(zhǎng)因子的表達(dá)。血管損傷后IL-1β表達(dá)增加與新生內(nèi)膜形成關(guān)系密切。組織蛋白酶S(Cat S)可以降解細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)，促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)遷移，導(dǎo)致新生內(nèi)膜形成。IL-1β可以促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞中Cat S的表達(dá)，但是兩者之間的時(shí)效和量效關(guān)

2、系尚不十分清楚。在大鼠VSMC中IL-1β通過(guò)哪些信號(hào)通道促進(jìn)CatS的表達(dá)也未見(jiàn)明確報(bào)道。 第一部分，目的:觀察IL-1β不同濃度和不同作用時(shí)間對(duì)大鼠VSMC中Cat S表達(dá)的影響，以及不同信號(hào)通道阻滯劑對(duì)IL-1β引起Cat S表達(dá)的抑制作用，探討IL-1β影響Cat S表達(dá)的機(jī)制。 方法:取SD大鼠胸主動(dòng)脈采用酶消化法進(jìn)行VSMC的分離和培養(yǎng)，取其4-5代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞中加入不同濃度的IL-1β作用24h或者加

3、入10ng/ml的IL-1β作用不同時(shí)間。在VSMC中加入10ng/ml的IL-1β，并分別加入特異性的ERK信號(hào)通道阻滯劑PD98059、P38MAPK信號(hào)通道阻滯劑SB203580、JNK信號(hào)通道阻滯劑SP600125、P13K信號(hào)通道阻滯劑LY294002和NF-κB阻滯劑PDTC作用24h。用逆轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)法和免疫細(xì)胞化學(xué)法測(cè)定大鼠VSMC中Cm S mRNA和蛋白表達(dá)的變化。 結(jié)論: I

4、L-1β可以呈劑量和時(shí)間依賴性刺激VSMC中Cat S表達(dá)。IL-1β可能通過(guò)ERK、P38、JNK、P13K和轉(zhuǎn)錄因子NF-κB促進(jìn)VSMC中Cat S表達(dá)。 血管平滑肌細(xì)胞遷移在血管損傷后新生內(nèi)膜形成中起著關(guān)鍵作用。Cat S能降解ECM的多種成分，促進(jìn)VSMC遷移，與內(nèi)膜增厚密切相關(guān)。NF-κB是一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄因子，可以調(diào)控多種基因產(chǎn)物的表達(dá)。阿托伐他汀有明顯抑制細(xì)胞遷移的作用，但是其機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。阿托伐他汀能否通過(guò)

5、抑制NF-κB減少Cat S表達(dá)，從而抑制細(xì)胞遷移目前尚不清楚。 第二部分，目的:觀察阿托伐他汀對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的大鼠VSMC遷移及NF-κB和Cat S表達(dá)的影響，探討阿托伐他汀抑制細(xì)胞遷移的機(jī)制。 方法:取SD大鼠胸主動(dòng)脈用酶消化法進(jìn)行VSMC的分離和培養(yǎng)，取其4-5代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。用Boyden小室實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)半胱氨酸蛋白酶抑制劑E64d和不同濃度阿托伐他汀對(duì)IL-1β所致大鼠VSMC遷移的影響。用10ng/ml IL

6、-1β刺激大鼠VSMC中Cat S表達(dá)，并分別加入不同濃度的阿托伐他汀作用24h進(jìn)行干預(yù)，用細(xì)胞免疫化學(xué)法檢測(cè)細(xì)胞中NF-κB表達(dá)，用細(xì)胞免疫化學(xué)和RT-PCR法檢測(cè)Cat S表達(dá)。 結(jié)果: 1、IL-1β組細(xì)胞遷移數(shù)(27±4)較正常對(duì)照組(6±2)相比明顯增加(P<0.01)。阿托伐他汀可以劑量依賴性地抑制IL-1β所致的大鼠VSMC遷移。1μmol/L和10μmol/L阿托伐他汀組細(xì)胞遷移數(shù)較IL-1β組分別減少2

7、2.22％和55.56％，均P<0.01。0.1μmol/L阿托伐他汀組(25±4)與IL-1β組相比無(wú)顯著性差異(P>0.05)。與IL-1β組相比E64d組(10±2)細(xì)胞遷移數(shù)也明顯減少，P<0.01。 2、阿托伐他汀可以呈劑量依賴性地抑制IL-1β所致的大鼠VSMC中Cat S mRNA表達(dá)。與IL-1β組(0.88±0.08)相比，1μmol/L和10μmol/L阿托伐他汀組使Cat S表達(dá)分別下降19.32％和56.

8、81％，兩兩比較均P<0.01。0.1μmol/L阿托伐他汀組Cat S mRNA表達(dá)(0.84±0.07)與IL-1β組相比無(wú)顯著性差異(P>0.05)。 3、與IL-1β組(18.94±1.50)相比，1μmol/L和10μmol/L阿托伐他汀組Cat S免疫細(xì)胞化學(xué)評(píng)分分別為15.56±1.13和9.72±0.78，兩兩比較均P<0.01。0.1μmol/L阿托伐他汀組(18.35±1.36)與IL-1β組相比無(wú)顯著性差異

9、(P>0.05)。 4、與正常對(duì)照組(1.04±0.01)相比，IL-1β使大鼠VSMC中NF-κB表達(dá)(18.85±1.46)明顯增加。與IL-1β組相比，1μmol/L和10μmol/L阿托伐他汀組NF-κB評(píng)分分別為15.37±1.15和9.58±0.80(兩兩比較均P<0.01)，呈明顯劑量依賴性。0.1μmol/L阿托伐他汀組NF-κB表達(dá)(18.20±1.53)與IL-1β組無(wú)顯著性差異(P>0.05)。 結(jié)

10、論 組織蛋白酶在IL-1β引起的大鼠VSMC遷移中起重要作用，阿托伐他汀可以劑量依賴性地抑制IL-1β引起的大鼠VSMC遷移。阿托伐他汀可以劑量依賴性地抑制IL-1β引起的大鼠VSMC中NF-κB和Cat S表達(dá)。阿托伐他汀可能通過(guò)抑制NF-κB使Cat S表達(dá)減少，從而抑制VSMC遷移。 經(jīng)皮腔內(nèi)冠狀動(dòng)脈血管成形術(shù)是冠心病治療的一種重要方法，但是，部分病人在術(shù)后6個(gè)月出現(xiàn)血管內(nèi)再狹窄，嚴(yán)重影響了該手術(shù)方式的遠(yuǎn)期療效。新

11、生內(nèi)膜形成在再狹窄的發(fā)生中起著重要作用，VSMC從中膜向內(nèi)膜遷移是新生內(nèi)膜形成的一個(gè)主要原因。Cat S能降解ECM的多種成分，促進(jìn)VSMC遷移，與新生內(nèi)膜的形成密切相關(guān)。阿托伐他汀有明顯抑制新生內(nèi)膜形成的作用，但是其機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。阿托伐他汀能否通過(guò)抑制Cat S表達(dá)減輕新生內(nèi)膜形成目前尚不清楚。 第三部分，目的:觀察阿托伐他汀對(duì)大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷后新生內(nèi)膜形成和NF-κB及Cat S表達(dá)的影響，探討阿托伐他汀減輕血管球囊

12、損傷后新生內(nèi)膜形成的機(jī)制。 方法:32只雄性SD大鼠，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、假手術(shù)組、手術(shù)組和阿托伐他汀組，每組8只，均予普通飲食。假手術(shù)組左側(cè)頸動(dòng)脈送入球囊但不行球囊損傷。手術(shù)組和阿托伐他汀組行左側(cè)頸動(dòng)脈球囊損傷，阿托伐他汀組在術(shù)后予阿托伐他汀10mg·kg<'-1>·d<'-1>。各組術(shù)前、術(shù)后1天和術(shù)后28天采血用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)測(cè)定血清IL-1β變化。動(dòng)物喂養(yǎng)28天后處死取左側(cè)頸動(dòng)脈行病理形態(tài)學(xué)檢測(cè)，用免疫組

13、化法檢測(cè)NF-κB表達(dá)，用RT-PCR和免疫組化法測(cè)定Cat S表達(dá)。 結(jié)果: 1、四組術(shù)前、術(shù)后1天和術(shù)后28天血清IL-1β水平均無(wú)顯著性差異。 2、與正常對(duì)照組和假手術(shù)組相比，手術(shù)組內(nèi)膜面積〔(148.62+8.84)×10<'3>μm<'2>〕和內(nèi)膜/中膜面積(I/M)比值(2.06±0.15)均明顯增加，P<0.01。阿托伐他汀組內(nèi)膜面積〔(64.75±5.12)×10<'3>μm<'2>〕和I/M比值

14、(0.90±0.05)與手術(shù)組相比均明顯減少，P<0.01。四組中膜面積無(wú)顯著性差異(P>0.05)。 3、正常對(duì)照組和假手術(shù)組基本無(wú)Cat S mRNA表達(dá)，手術(shù)組CatS mRNA表達(dá)(0.83±0.07)明顯增加，P<0.01。與手術(shù)組相比，阿托伐他汀組Cat S mRNA表達(dá)(0.48±0.04)明顯減少，P<0.01。 4、正常對(duì)照組和假手術(shù)組無(wú)明顯Cat S陽(yáng)性表達(dá)，手術(shù)組和阿托伐他汀組內(nèi)膜Cat S陽(yáng)性表達(dá)

15、明顯增加。與手術(shù)組(15.28±1.42)相比，阿托伐他汀組Cat S免疫組化評(píng)分(8.50±0.73)明顯減少，P<0.01。 5、正常對(duì)照組和假手術(shù)組無(wú)明顯NF-κB陽(yáng)性表達(dá)，手術(shù)組和阿托伐他汀組內(nèi)膜NF-κB陽(yáng)性表達(dá)明顯增加。與手術(shù)組(12.45±1.30)相比，阿托伐他汀組NF-κB免疫組化評(píng)分(6.74±0.54)明顯減少，P<0.01。 6、內(nèi)膜面積分別與Cat S mRNA表達(dá)、Cat S及NF-κB免疫組