阿托伐他汀對大鼠主動脈自然衰老的干預(yù)作用及機(jī)制探討.pdf

1、本研究以自然衰老模型為代表，做以下三個環(huán)節(jié)的研究。
　　一、自然倍增誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞(Vascular smooth muscle cell，VSMC)衰老及阿托伐他汀干預(yù)作用
　　研究首先根據(jù)前期課題組在老年鼠分離培養(yǎng)胸主動脈血管平滑肌細(xì)胞的實驗基礎(chǔ)上，采用改進(jìn)體外培養(yǎng)傳代復(fù)制性衰老的方式，獲得體外細(xì)胞培養(yǎng)模擬細(xì)胞衰老模型。實驗細(xì)胞依據(jù)群體倍增水平(population doubling level，PDL)分4組:青年

2、組(6PDL)，中年組(14PDL)，老年組(24PDL)，老年藥物組（于中年組時期細(xì)胞培養(yǎng)液中開始定量添加阿托伐他汀溶解藥物直至老年組時期，劑量為10μmol/L）。按照藥物和各組干預(yù)時間終點后，采用免疫組織化學(xué)染色法觀察衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶的活性，采用CCK-8法與流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期來觀察細(xì)胞增殖能力。采用JC-1與TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡情況。然后觀察細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷指標(biāo):丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量

3、和超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)活性及NOS系統(tǒng)相關(guān)指標(biāo)（NO的總含量，NOS活性）的變化。Real-time PCR測定NOS系統(tǒng)（eNOS與iNOS）mRNA的含量，免疫印跡法測定eNOS與iNOS的蛋白表達(dá)，免疫熒光法觀察eNOS與iNOS的細(xì)胞定位及表達(dá)情況。結(jié)果表明:(1)隨著細(xì)胞傳代的延續(xù)，VSMC出現(xiàn)衰老表型(F=156.751，P＜0.001)，與青年組、中年組比較，老年組SA-β半乳

4、糖苷酶染色陽性細(xì)胞百分比和細(xì)胞周期檢測G0/G1期細(xì)胞比例明顯增加(P＜0.05)。(2)細(xì)胞內(nèi)MDA含量增加(F=38.640，P＜0.001)，SOD活性下降（F=191.888，P＜0.001），表明體外培養(yǎng)傳代模型成功誘導(dǎo)VSMC衰老，提示氧化應(yīng)激是血管平滑肌細(xì)胞衰老的重要機(jī)制。NO含量降低(F=28.736，P＜0.001)，鈣依賴性NOS活性隨細(xì)胞傳代次數(shù)增加而下降(F=67.070，P＜0.001)，非鈣依賴性NOS活性增

5、加(F=67.070，P＜0.001)。隨傳代次數(shù)的逐漸增加，eNOS的表達(dá)下降(F=187.907，P＜0.001)，而iNOS的表達(dá)升高（F=329.748，P＜0.001），eNOS/iNOS的比值逐漸下降，提示NOS系統(tǒng)失調(diào)也是血管細(xì)胞衰老的重要機(jī)制之一。(3)與老年組比較，老年藥物組通過較長時期的阿托伐他汀干預(yù)后SOD的活性增加(P＜0.05)，MDA含量減少（P＜0.05），提高了NO的含量以及鈣依賴性NOS活性(P＜0.0

6、5)，降低了非鈣依賴性NOS的活性(P＜0.05)。免疫熒光發(fā)現(xiàn)NOS系統(tǒng)表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，隨著傳代次數(shù)的遞增，而eNOS的熒光強(qiáng)度逐漸下降，iNOS的熒光強(qiáng)度逐漸升高，老年藥物組能抑制iNOS的表達(dá)并通過增加eNOS的表達(dá)而使得失衡的NOS系統(tǒng)趨于平衡。
　　二、自然增齡誘導(dǎo)大鼠主動脈血管衰老及阿托伐他汀干預(yù)作用
　　為進(jìn)一步探討氧化應(yīng)激與NOS系統(tǒng)失衡在血管衰老中的作用，我們又從自然衰老動物模型的角度觀察了增齡過程中主動脈血

7、管的變化情況以及阿托伐他汀干預(yù)后的相應(yīng)影響。實驗分為四組:青年鼠組（2月齡，n=8），中年鼠組(12月齡，n=8)，老年鼠組（20月齡，n=8），老年鼠藥物組(從12月齡開始添加含有阿托伐他汀的復(fù)合飼料喂養(yǎng)至20月齡，n=8，劑量為5mg/kg.d)。依照各組的干預(yù)終點，開胸取胸主動脈，檢測血管環(huán)張力變化;運(yùn)用免疫組化染色法觀察衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶的活性;觀察細(xì)胞氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo):MDA的含量與SOD的活性;針對NOS系統(tǒng)相關(guān)指標(biāo)來檢

8、測NO總含量和NOS的活性。Real-timePCR測定eNOS與iNOS mRNA的含量，免疫印跡法測定eNOS與iNOS的蛋白表達(dá)，免疫組織化學(xué)法觀察eNOS與iNOS的表達(dá)情況。結(jié)果表明:(1)隨著增齡改變，內(nèi)皮依賴的血管舒張功能顯著下降(F=70.346，P＜0.001)，非內(nèi)皮依賴的舒張功能也有下降趨勢。阿托伐他汀干預(yù)后可以改善血管舒張功能（P＜0.05)。(2)伴隨年齡增長，與青年鼠組和中年鼠組比較，老年鼠組SA-β-半乳糖

9、苷酶染色的陽性細(xì)胞光密度值增加（F=79.486，P＜0.001）。(3)主動脈標(biāo)本中，老年鼠組MDA含量增加（F=132.420，P＜0.001），SOD活性下降（F=241.340，P＜0.001），表明活體組織增齡改變成功誘導(dǎo)主動脈血管衰老，提示氧化應(yīng)激是血管老化的重要機(jī)制之一。NO的含量降低(F=27.208，P＜0.001)，鈣依賴性NOS活性隨年齡增長而下降（F=86.555，P＜0.001），非鈣依賴性NOS活性增加（F=

10、86.555，P＜0.001）。隨年齡的逐漸增長，eNOS的表達(dá)下降(F=141.618，P＜0.001)，而iNOS的表達(dá)升高(t=-10.903，P＜0.001)，eNOS/iNOS的比值逐漸下降，提示NOS系統(tǒng)失調(diào)也是血管衰老的重要機(jī)制之一。(4)與老年鼠組比較，老年鼠藥物組通過阿托伐他汀長期干預(yù)后SOD的活性增加(P＜0.05)，MDA的含量減少(P＜0.05)，并且提高了NO的含量以及鈣依賴性NOS活性(P＜0.05)，降低了

11、非鈣依賴性NOS的活性（P＜0.01）。免疫組化發(fā)現(xiàn)隨著年齡的遞增，eNOS的表達(dá)逐漸下降，而iNOS在老年組表達(dá)最高，阿托伐他汀干預(yù)后能抑制老年鼠藥物組iNOS的表達(dá)并通過增加eNOS的表達(dá)而使得失衡的NOS系統(tǒng)趨于平衡。
　　三、SIRT1在大鼠胸主動脈血管和平滑肌細(xì)胞衰老中的作用及阿托伐他汀的干預(yù)機(jī)制
　　為進(jìn)一步探討SIRT1在自然衰老模型中發(fā)揮的作用以及阿托伐他汀的干預(yù)影響，我們分別對各組主動脈血管組織和血管平滑肌

12、細(xì)胞中的SIRT1表達(dá)進(jìn)行了檢測。
　　1、在血管平滑肌細(xì)胞中，運(yùn)用Real-time定量PCR法測定SIRT1 mRNA的含量，免疫印跡法檢測SIRT1的蛋白表達(dá)，免疫熒光法定位SIRT1在細(xì)胞中的表達(dá)區(qū)域與情況。結(jié)果提示:(1) SIRT1主要表達(dá)于細(xì)胞核內(nèi)，隨著細(xì)胞傳代衰老(F=267.107，P＜0.001)，老年組SIRT1的表達(dá)明顯低于中年組(P＜0.05)和青年鼠組(P＜0.05)。而通過阿托伐他汀的干預(yù)后，與老年鼠

13、組比較，老年鼠藥物組SIRT1的表達(dá)上調(diào)(P＜0.05)。(2)血管平滑肌細(xì)胞中SIRT1與NOS系統(tǒng)的相關(guān)性分析顯示:SIRT1的表達(dá)與eNOS呈正相關(guān)關(guān)系（r=0.919，P＜0.001），與iNOS呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.988，P＜0.01)。而SIRT1與NOS系統(tǒng)的比值也呈正相關(guān)關(guān)系（r=0.932，P＜0.01）。
　　2、在主動脈血管中，運(yùn)用Real-time定量PCR法測定SIRT1 mRNA的含量，免疫印跡法檢

14、測SIRT1蛋白的表達(dá)，免疫組化法定位SIRT1在主動脈中的表達(dá)區(qū)域與情況。結(jié)果提示:(1)隨著主動脈增齡衰老(F=168.199，P＜0.001)，老年組SIRT1的表達(dá)明顯低于中年組（P＜0.05）和青年組(P＜0.05)。而通過阿托伐他汀的干預(yù)后，與老年組比較，老年藥物組SIRT1的表達(dá)上調(diào)(P＜0.05)。(2)主動脈中SIRT1與NOS系統(tǒng)的相關(guān)性分析顯示:SIRT1的表達(dá)與eNOS呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.975，P＜0.001

15、)，與iNOS呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.972，P＜0.001)。而SIRT1與NOS系統(tǒng)的比值也呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.989，P＜0.001)。
　　通過以上針對體內(nèi)主動脈血管組織及體外血管平滑肌細(xì)胞的衰老模型研究，可以推斷eNOS/iNOS的比值與SIRT1存在正相關(guān)關(guān)系。
　　結(jié)論:
　　通過本研究，我們能夠得出以下結(jié)論:
　　1、通過體外傳代模擬細(xì)胞自然衰老，會出現(xiàn)氧化應(yīng)激程度加重與NOS系統(tǒng)失調(diào)。這些提示

16、細(xì)胞衰老會增加胞內(nèi)氧化應(yīng)激損傷的情況，在下調(diào)eNOS表達(dá)的同時，會上調(diào)iNOS，繼而造成NOS系統(tǒng)比值的平衡失調(diào)。
　　2、通過自然增齡模擬體內(nèi)主動脈衰老，造成血管舒張功能出現(xiàn)障礙。這提示伴隨衰老會加重血管中氧化應(yīng)激程度，加重NOS系統(tǒng)的失調(diào)，減少NO在老齡鼠主動脈中的生物利用度，血管舒張功能發(fā)生改變。
　　3、在體內(nèi)及體外實驗中進(jìn)行長期阿托伐他汀的干預(yù)，既可以在細(xì)胞中減輕氧化應(yīng)激帶來的損傷，恢復(fù)NOS系統(tǒng)的平衡，又可以在主