FTY720在七氟醚誘導(dǎo)的大鼠進(jìn)行性神經(jīng)毒性中的保護(hù)效應(yīng).pdf

1、目的：FTY720所產(chǎn)生的神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)是否能夠?qū)蛊叻岩l(fā)的神經(jīng)毒性。
　　方法：
　　1.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
　　所有的實(shí)驗(yàn)程序都獲得山東省立醫(yī)院動(dòng)物常務(wù)委員會(huì)批準(zhǔn)，120只7天齡SD大鼠從中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院獲得，動(dòng)物可以自由飲水進(jìn)食，并提供12小時(shí)晝夜循環(huán)。
　　2.初級(jí)海馬神經(jīng)元的準(zhǔn)備
　　海馬神經(jīng)元是由18天大鼠制取，海馬組織從頭部解剖，神經(jīng)元通過(guò)胰蛋白酶和研磨來(lái)分離。神經(jīng)元被保存在37℃含5％C02和95

2、％空氣潮濕環(huán)境的無(wú)血漿B27母細(xì)胞介質(zhì)中。神經(jīng)元是經(jīng)體外實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)7天采用抗-MAP抗體提純。
　　3.麻醉暴露
　　神經(jīng)元在4×105/ml密度的六孔盤(pán)中培養(yǎng)。大鼠幼崽在一個(gè)37℃的密閉空間內(nèi)接觸七氟醚，七氟醚由一個(gè)固定口徑的噴霧器向空間內(nèi)傳送。接觸氣體包括七氟醚混合了3％的C02、21％的02和平衡N2。
　　活體實(shí)驗(yàn)是采用出生后7天的大鼠幼崽。隨機(jī)分成5組（n=24每組）。對(duì)照組暴露在5％C0221％02和平衡N2

3、混合氣體中6小時(shí)，其他四組的所有大鼠注射溶劑(DMSO)、FTY720(1mg/Kg)，F(xiàn)TY720和MEK抑制劑(U012610mg/Kg)，或者FTY720和VPC20319(0.5 mg/Kg)。均暴露于2.1％的七氟醚5％C0221％02和平衡N2混合氣體中6小時(shí)。我們選擇2.1％的七氟醚濃度是與臨床相關(guān)的大鼠不能致死的濃度。氣體以2L/min速度吹入大鼠的環(huán)境中。七氟醚暴露后，每組中12只大鼠立即被實(shí)施安樂(lè)死，采集海馬組織做免

4、疫印跡分析。其他大鼠繼續(xù)生長(zhǎng)至35天用作神經(jīng)認(rèn)知評(píng)估。
　　4.免疫印跡分析
　　正如前面描述的海馬組織和神經(jīng)元培養(yǎng)為免疫印跡做準(zhǔn)備。神經(jīng)元培養(yǎng)和海馬組織的溶解產(chǎn)物以12％的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺瓊脂電泳分離，然后進(jìn)行PVDF轉(zhuǎn)膜。初級(jí)抗體為抗ERK11/2抗體以及抗Bax抗體和抗Bcl-2抗體，隨后用辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的二級(jí)抗體孵育并顯色分析。
　　5.細(xì)胞凋亡分析
　　細(xì)胞凋亡的檢測(cè)采用FITC標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白

5、V(Annexin V)凋亡試劑盒進(jìn)行。細(xì)胞用冰的磷酸鹽緩沖劑洗脫，然后以1×106cell/ml的濃度以緩沖液混懸。細(xì)胞采用膜聯(lián)蛋白v-FITC和Propidium iodide在黑暗環(huán)境中染色15分鐘后以流式細(xì)胞儀分析。Annexin V-FITC陽(yáng)性且Propidium iodide陰性的細(xì)胞被認(rèn)為是凋亡細(xì)胞。
　　6.神經(jīng)損傷的評(píng)估
　　曠場(chǎng)試驗(yàn)是用來(lái)評(píng)估一般運(yùn)動(dòng)活動(dòng)、探索習(xí)慣和前面提到的焦慮。大鼠幼崽被暴露于七氟醚

6、中，然后置于曠場(chǎng)中，觀察大鼠在一定時(shí)間內(nèi)所通過(guò)區(qū)域數(shù)值。物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)是用兩組新事物識(shí)別任務(wù)來(lái)評(píng)估，大鼠幼崽在接觸七氟醚之前，先在盒子中用兩個(gè)識(shí)別物體來(lái)預(yù)檢測(cè)建立基線。七氟醚暴露后，將大鼠幼崽放在盒子里，允許它們探索兩個(gè)放置在一定距離的識(shí)別物體三分鐘。它們被移入盒子兩小時(shí)后將其中一個(gè)熟悉的物體換成不同形狀和外觀再重新測(cè)試。探索所有物體的時(shí)間被記錄。數(shù)據(jù)用大鼠幼崽探索新物體與熟悉物體時(shí)間百分比來(lái)表示。
　　結(jié)果：
　　1.七氟醚

7、是以一種時(shí)間依賴性方式誘發(fā)神經(jīng)元凋亡。
　　神經(jīng)元凋亡在七氟醚暴露3，6，9小時(shí)后采用流式細(xì)胞儀評(píng)估。與對(duì)照組相比神經(jīng)元凋亡隨時(shí)間增長(zhǎng)。神經(jīng)元凋亡數(shù)分別是11.4±0.5％，24.9±1.9％，28.2±2.3％。相反，對(duì)照組暴露于混合氣體組9小時(shí)后凋亡率無(wú)明顯變化。
　　2.FTY720減輕體外實(shí)驗(yàn)七氟醚誘發(fā)的神經(jīng)元凋亡。
　　為了闡述FTY720對(duì)于七氟醚誘發(fā)神經(jīng)元凋亡的保護(hù)效應(yīng)，細(xì)胞在暴露七氟醚時(shí)用不同濃度的FT

8、Y720培養(yǎng)。之前的研究表明超生理微摩爾濃度的FTY720致大鼠小腦神經(jīng)元凋亡。此外，一項(xiàng)早期臨床前期動(dòng)物模型研究報(bào)道0.14μM濃度的FTY720才具有治療作用。因此，在我們的實(shí)驗(yàn)中，我們檢測(cè)5-10nM的FTY720對(duì)神經(jīng)元的凋亡效應(yīng)。結(jié)果表明，10nM濃度的FTY720能有效保護(hù)神經(jīng)元對(duì)抗七氟醚的促凋亡作用。（17.2±1.3％，P＜O.05，七氟醚暴露6小時(shí)）。應(yīng)用FTY72050和100nM濃度，凋亡細(xì)胞降低到8.9±1.1％

9、和6.1±0.7％。
　　3.FTY720激活的S1P受體能夠預(yù)防體外實(shí)驗(yàn)七氟醚誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡
　　當(dāng)FTY720被2型SPHK轉(zhuǎn)化成磷酸鹽時(shí)，在毫微摩爾濃度下，便具備了S1P1、S1P3、S1P4、S1P5的全激動(dòng)劑功能。為了驗(yàn)證這一假設(shè)FTY720主要擔(dān)當(dāng)神經(jīng)元中S1P1激動(dòng)劑的這一假設(shè)，我們檢測(cè)了選擇性S1P1激動(dòng)劑SEW2871和S1P1拮抗劑VPC23019對(duì)于七氟醚誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡作用，0.5μM的SEW2

10、871與50nM的FTY720具有相似的神經(jīng)保護(hù)作用。反之，0.5μM的VPC23019能夠消除FTY720的神經(jīng)保護(hù)作用?？傊?，這些結(jié)果表明FTY720對(duì)于S1P1的激活能夠阻礙七氟醚誘發(fā)的神經(jīng)凋亡。
　　4.FTY720通過(guò)使ERK l/2磷酸化來(lái)防止神經(jīng)元凋亡
　　新的證據(jù)表明通過(guò)S1P1受體的存活信號(hào)與ERK l/2相關(guān)。因此，我們測(cè)試FTY720是否能夠通過(guò)激活ERK l/2發(fā)揮抗凋亡作用。當(dāng)培養(yǎng)的神經(jīng)元暴露于七氟

11、醚中時(shí)，暴露組與對(duì)照組相比磷酸化的ERK1/2顯著降低，然而，F(xiàn)TY720組的磷酸化ERKl/2(p-ERKl/2)水平能夠顯著維持。此外，VPC23019處理能夠消除暴露于七氟醚下的FTY720對(duì)于p-ERKl/2水平的維持作用，表明FTY720通過(guò)結(jié)合S1P1受體來(lái)激活ERKl/2信號(hào)傳導(dǎo)。為了進(jìn)一步明確ERK l/2在FTY720神經(jīng)保護(hù)中的作用，在神經(jīng)元暴露于七氟醚時(shí)用FTY720和MEK抑制劑(U0126，5μM)處理， FT

12、Y720的抗凋亡作用被U0126消除，這些數(shù)據(jù)表明，F(xiàn)TY720通過(guò)S1P1依賴的ERK l/2路徑激活來(lái)保護(hù)神經(jīng)元對(duì)抗七氟醚誘導(dǎo)的凋亡。
　　5.FTY720通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl2/Bax比例來(lái)減弱七氟醚誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性。
　　麻醉劑誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡對(duì)麻醉劑神經(jīng)毒性其重要作用。為了檢驗(yàn)Bcl-2/Bax比例的調(diào)節(jié)是否是FTY720對(duì)抗七氟醚誘發(fā)神經(jīng)凋亡的基礎(chǔ)，我們檢測(cè)Bcl-2，Bax細(xì)胞凋亡蛋白的水平。我們的結(jié)果表明七氟醚暴露能

13、明顯降低Bcl-2/Bax比例，導(dǎo)致斷裂細(xì)胞凋亡蛋白酶-3水平升高。相反，F(xiàn)TY720升高和Bcl-2/Bax比例的降低，能夠使七氟醚處理過(guò)的神經(jīng)元中的斷裂細(xì)胞凋亡蛋白酶-3減少。此外，我們發(fā)現(xiàn)，加入VPC23019或U0125能夠逆轉(zhuǎn)FTY720對(duì)于暴露七氟醚的神經(jīng)元的調(diào)節(jié)效應(yīng)?？偠灾現(xiàn)TY720通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax比例來(lái)防止七氟醚誘發(fā)的神經(jīng)凋亡。Bcl-2/Bax比例調(diào)節(jié)是通過(guò)S1P1依賴的ERKl/2激活來(lái)完成。

14、　　6.FTY720能夠減輕七氟醚暴露引起的神經(jīng)損傷
　　FTY720的神經(jīng)保護(hù)作用采用大鼠幼崽做測(cè)試，有報(bào)道稱給予大鼠0.1～1Mmg/kg的FTY720時(shí)，血漿濃度低于lng/ml，給予lmg/kg是安全的。因此，大鼠幼崽在暴露七氟醚之前注射媒介物(DMSO)或lmg/kgFTY720，F(xiàn)TY720和MEK抑制劑(U0126，lmg/kg)或FTY720和VPC23019（0.5mg/kg）。盡管七氟醚加媒介組大鼠活動(dòng)距離輕微

15、降低，但與其他組比無(wú)顯著差異，表明大鼠沒(méi)有情緒抑制及運(yùn)動(dòng)功能障礙，反之，應(yīng)用兩個(gè)物體間的識(shí)別任務(wù)實(shí)驗(yàn)來(lái)測(cè)試學(xué)習(xí)和識(shí)別記憶。七氟醚加媒介組的大鼠幼崽在探索新物體時(shí)花費(fèi)了更多的時(shí)間，然而七氟醚加FTY720組與對(duì)照組花費(fèi)時(shí)間相似，表明FTY720可以降低七氟醚誘發(fā)的神經(jīng)認(rèn)知損傷。我們同時(shí)觀察到共同應(yīng)用U0126和VPC23019能夠消除FTY720對(duì)于七氟醚誘發(fā)的神經(jīng)毒性的神經(jīng)保護(hù)作用。
　　7.FTY720通過(guò)抑制七氟醚誘發(fā)的神經(jīng)元

16、凋亡來(lái)提高神經(jīng)產(chǎn)物。
　　為了進(jìn)一步明確FTY720通過(guò)防止神經(jīng)元凋亡來(lái)保護(hù)大鼠幼崽對(duì)抗七氟醚誘發(fā)的神經(jīng)毒性，我們采用免疫印跡分析法檢測(cè)凋亡分子與體外試驗(yàn)相似，注射了FTY720的大鼠神經(jīng)元凋亡數(shù)少于只注射媒介組。由斷裂細(xì)胞凋亡蛋白酶-3水平的降低可以證明，此外，向大鼠體內(nèi)注射FTY720的同時(shí)注射U0126或VPC23019，斷裂細(xì)胞凋亡蛋白酶-3水平升高，出現(xiàn)了與活體實(shí)驗(yàn)一致的神經(jīng)保護(hù)作用。在活體內(nèi)FTY720對(duì)于Bcl-2，

17、Bax和ERK l/2的調(diào)節(jié)效應(yīng)也被檢測(cè)到，表明了在活體內(nèi)FTY720通過(guò)S1P1依賴的ERK l/2信號(hào)傳導(dǎo)路激活來(lái)調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax比例。
　　結(jié)論：
　　通過(guò)我們的研究，可以與既往的研究相互印證，證實(shí)七氟醚可以誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡，并可以導(dǎo)致大鼠神經(jīng)系統(tǒng)的損傷，導(dǎo)致認(rèn)知與學(xué)習(xí)能力的降低，但是對(duì)于深層次的情緒方面如焦慮并沒(méi)有明顯影響。FTY720對(duì)七氟醚導(dǎo)致的神經(jīng)元凋亡以及大鼠神經(jīng)系統(tǒng)出現(xiàn)的損傷具有保護(hù)作用，可以消除七氟醚