KIAA0280在缺氧誘導神經(jīng)元凋亡中的作用研究.pdf

1、大腦動脈阻塞引起的中風和腦梗死，因其在老年人中致殘高和易引起智能缺陷，成為嚴重影響人們健康的世界性難題。隨著人類壽命的延長，遭受這種疾病的患者數(shù)量將進一步增加。最近，人們對局部缺血引起腦損傷的分子生物學機制研究取得了突破性進展，在基礎(chǔ)藥理的動物實驗中報道了很多具有很強的大腦保護作用、頗有治療前景的藥物。然而，目前，針對腦缺血性中風的治療藥物仍然有限。在近幾年的實驗研究中，人們相繼闡明由谷氨酸、Ca2+、局部腦缺血的基因差異表達、凋亡引起

2、的神經(jīng)元死亡，腦局部缺血后的炎癥反應等介導的缺血性神經(jīng)元死亡機制。Kitagawa等于1990年報道了短暫缺血預處理能誘導缺血性耐受，產(chǎn)生神經(jīng)保護作用。 有鑒于此，我們課題組的臧林泉等人研究發(fā)現(xiàn)急性局灶性腦缺血大鼠缺血組織與非缺血組織中存在基因差異表達，克隆出與腦缺血相關(guān)的基因KIAA0280，其在急性局灶性腦缺血大鼠中明顯上調(diào)表達，該基因的功能在國內(nèi)外均未見報道，其顯著地差異表達提示其在腦缺血病理過程中具有重要作用。

3、實驗證實，缺血性神經(jīng)元的死亡相當一部分是通過細胞凋亡的機制來實現(xiàn)。細胞凋亡過程涉及一系列基因和蛋白的表達，caspase，bcl-2等等，并在凋亡發(fā)生過程中會有新的物質(zhì)來對凋亡作出調(diào)控。為此，我們研究KIAA0280在不同因素誘導神經(jīng)元凋亡中的表達，將有助于明確其在凋亡中功能作用，為研究其在凋亡中的作用機制奠定基礎(chǔ)，豐富細胞凋亡學說的內(nèi)容，為臨床治療腦中風，心肌梗死，腎衰等與細胞凋亡相關(guān)的疾病提供新的治療方法。 目的:

4、通過建立原代神經(jīng)元的體外培養(yǎng)技術(shù)和不同因素誘導的神經(jīng)元凋亡模型；研究KIAA0280在不同因素誘導誘導神經(jīng)元凋亡中表達情況；研究KIAA0280被特異性沉默后，基因的表達情況以及沉默KIAA0280后，對凋亡神經(jīng)元的影響。 方法: （1）用原代分離、培養(yǎng)的方法，建立神經(jīng)元的體外培養(yǎng)技術(shù)； （2）將神經(jīng)元放置于一密閉容器，然后抽真空，再充以95％N2，5％CO2，放入37℃培養(yǎng)箱中，分別缺氧不同時間，用Hoechs

5、t33258法, 乳酸脫氫酶法, SRB法檢測神經(jīng)元的凋亡，建立缺氧誘導細胞凋亡模型； （3）建立谷氨酸誘導神經(jīng)元凋亡模型，用Hoechst33258法、乳酸脫氫酶法、SRB法檢測神經(jīng)元凋亡，建立腦缺血興奮性氨基酸毒性細胞模型； （4）建立過氧化氫誘導神經(jīng)元凋亡模型，用Hoechst33258法、乳酸脫氫酶法、SRB法檢測神經(jīng)元凋亡，建立腦缺血再灌注細胞模； （5）用RT-PCR特異性擴增出不同神經(jīng)元凋亡模型中K

6、IAA0280在神經(jīng)元中的表達，觀察不同因素引起的神經(jīng)元凋亡中KIAA0280的表達變化； （6）用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法，將KIAA0280基因特異性siRNA轉(zhuǎn)染進神經(jīng)元，觀察轉(zhuǎn)染前后神經(jīng)元的生長變化，以及轉(zhuǎn)染前后，凋亡神經(jīng)元變化情況。 結(jié)果： （1）本實驗成功建立原代神經(jīng)元的體外培養(yǎng)技術(shù)，分離成功率高，神經(jīng)元生長良好，存活率高，可存活30天以上。 （2）用密閉容器抽真空的方法建立缺氧誘導神經(jīng)元凋亡的模型。

7、 LDH，SRB的檢測結(jié)果（P<0.05）表明本實驗所建立細胞凋亡模型是成功的。RT-PCR結(jié)果表明在缺氧神經(jīng)元中KIAA0280基因的表達明顯上調(diào)，采用RNAi沉默KIAA0280的表達后，神經(jīng)元的凋亡加重。 （3）用谷氨酸誘導神經(jīng)元凋亡，復制興奮性氨基酸對神經(jīng)系統(tǒng)的毒性作用細胞模型。結(jié)果顯示，谷氨酸誘導神經(jīng)元凋亡模型成功；RT-PCR結(jié)果顯示，KIAA0280在谷氨酸誘導的凋亡神經(jīng)元中沒見明顯表達，Hoechst33258和

8、LDH結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染KIAA0280特異性siRNA后，凋亡神經(jīng)元的變化不明顯。 （4）用H2O2誘導神經(jīng)元凋亡，復制腦缺血再灌氧自由基損傷的體外細胞模型。結(jié)果顯示，H2O2誘導神經(jīng)元凋亡模型成功；RT-PCR結(jié)果顯示，KIAA0280在H2O2誘導的凋亡神經(jīng)元中沒有明顯的表達，Hoechst33258和LDH結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染KIAA0280特異性siRNA后，凋亡神經(jīng)元的變化不明顯。 結(jié)論： 本實驗成功建立原