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文檔簡介
1、研究背景: 一氧化氮(Nitricoxide,NO)在神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛存在,無論在生理狀態(tài)或病理狀態(tài)下,都是一個重要的信號分子[1]。生理狀態(tài)下低濃度NO可促進細胞增殖、分化等,而高濃度則導致細胞凋亡甚至壞死[2]。在腦缺血缺氧損傷,氧化應激等條件下,腦內(nèi)過量的NO表現(xiàn)出明顯的細胞毒性[3]。研究發(fā)現(xiàn),NO通過阻斷線粒體氧化呼吸鏈、直接損傷DNA或啟動內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應來誘導凋亡[4,5,6]。以往神經(jīng)元損傷研究已證實:細胞內(nèi)鈣離子在
2、上述通路中均起重要作用[7]。近年來,TRPC離子通道作為一類可調(diào)節(jié)細胞內(nèi)鈣濃度非特異性陽離子通道[8],其功能研究受到了廣泛關注。研究已表明,NO可激活TRPC離子通道并提高胞內(nèi)鈣離子濃度[9,10]。但TRPC離子通道是否因此參與NO誘導的神經(jīng)元凋亡呢?本研究以體外原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元為研究對象,對TRPC是否參與NO誘導的神經(jīng)元凋亡及其機制進行初步探討,以期為神經(jīng)損傷的防治研究提供新線索。 目的: 本研究通過SNP自
3、發(fā)釋放NO,誘導原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元凋亡,在此模型基礎上初步探討TRPC在凋亡中的作用及其機制,以期為神經(jīng)損傷的防治研究提供新思路。 方法: 原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元作為空白對照組,實驗組分為三組,分別為原代培養(yǎng)的神經(jīng)元中加入SNP,SNP+TRPC通道阻斷劑組;SNP+TRPC通道激活劑組。細胞處理24h后MTT比色法檢測各組細胞存活率,Hoechest33342熒光染色觀察細胞凋亡。采用Trizol提取細胞中的總RNA,R
4、T-PCR檢測TRPC在海馬神經(jīng)元上的表達情況,real-timeRT-PCR實驗檢測TRPC1以及凋亡相關基因mRNA水平的表達變化。 結(jié)果: 1.原代海馬神經(jīng)元的培養(yǎng)及鑒定,通過RT-PCR檢測TRPC1-6,發(fā)現(xiàn)所有的TRPC亞型在海馬神經(jīng)元均有表達。 2.①SNP(1mM)處理24小時,神經(jīng)元存活率為67.4%;與空白對照組有顯著差異(P<0.01,n=9),SNP+TRPC阻斷劑組(2-APB,SKF9
5、6365)神經(jīng)元存活率分別為102%、92.7%,與SNP組有顯著差異(P<0.01,n=8);而SNP+TRPC激活劑(OAG)組神經(jīng)元存活率為56.9%,與SNP組有統(tǒng)計學差異(P<0.05,n=9);單純給予TRPC阻斷劑或激動劑對神經(jīng)元存活率沒有影響(P>0.05)。 ②各組細胞處理后,Hoechst33342染色,熒光顯微鏡下觀察,空白對照組神經(jīng)元胞核均勻藍染;SNP處理組神經(jīng)元胞核明顯固縮、凝聚,可見高亮藍染的凋亡小
6、體;SNP+TRPC激動劑組凋亡細胞明顯增多;而SNP+TRPC阻斷劑組神經(jīng)元胞核均勻藍染,細胞無凋亡小體等凋亡特有的形態(tài)學變化。 3.給予SNP處理24小時后,通過real-timeRT-PCR檢測TRPC1的表達變化,發(fā)現(xiàn)SNP處理并不影響TRPC1mRNA在水平上的表達(P>0.05,n=6)。 4.通過real-timeRT-PCR檢測p53下游基因的表達變化,確認SNP誘導的海馬神經(jīng)元凋亡的p53下游信號分子。
7、結(jié)果顯示SNP處理神經(jīng)元4h、8h、24h后,p53下游靶基因Bax,Apaf-1和survivin表達無明顯變化P>0.05)。而PUMA則在三個時間點分別增加至1.95,1.82和1.96倍,與對照組相比有統(tǒng)計學意義(P<0.01,n=6)。 5.TRPC通道阻斷劑2-APB,顯著降低SNP誘導的PUMA上調(diào)(1.95vs1.13)(P<0.01,n=6)。 結(jié)論: TRPC1-6亞型在原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元上
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