P2X7R在乳腺癌中表達(dá)及其基因特異性ShRNA誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡的研究.pdf

1、　　目的：檢測(cè)乳腺癌組織及MCF-7細(xì)胞表面是否表達(dá)P2X7受體,探討針對(duì)P2X7R的shRNA對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖和凋亡的影響。
　　方法：(1)qPCR、Western blot、免疫組化技術(shù)檢測(cè)乳腺正常組織與乳腺癌病理組織的P2X7R的表達(dá)水平。(2)將針對(duì)P2X7基因特異性shRNA序列及Scramble shRNA序列插入pLKO.1表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞株MCF-7細(xì)胞,用qPCR和FCM檢測(cè)其P2X7R的表達(dá)水平

2、。(3)采用MTT法檢測(cè)P2X7R的拮抗劑KN-62與轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞的細(xì)胞生存率。(4)采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)抑制和凋亡率的變化。
　　結(jié)果：(1)qPCR、Western blot、免疫組化結(jié)果證明乳腺癌病理組織的P2X7R的表達(dá)水平高于乳腺正常組織,同時(shí)與雌激素受體(ER+)呈正相關(guān)性。(2)qPCR、FCM結(jié)果證實(shí)乳腺癌MCF-7細(xì)胞上P2X7R的表達(dá)升高。(3)穩(wěn)定細(xì)胞株的建立：通過(guò)嘌呤霉素(puro)

3、篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)P2X7R的MCF-7細(xì)胞株(MCF7/P2X7R-shRNA)和陰性對(duì)照細(xì)胞株(MCF7/Scramble shRNA),雙酶切后在2%的瓊脂糖膠進(jìn)行電泳,陽(yáng)性克隆會(huì)切出130bp的片段,兩條重組質(zhì)粒(PLK0.1-1.1-P2X7R-shRNA、PLK0.1-1.2-P2X7R-Scramble-shRNA)均符合設(shè)計(jì)要求。(4)經(jīng)測(cè)序鑒定證實(shí)成功構(gòu)建表達(dá)載體,用MTT法分析重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞后各組各時(shí)間段的

4、變化,發(fā)現(xiàn)MCF7/P2X7R–shRNA及KN-62組在各時(shí)間段與空白對(duì)照組相比均能夠明顯降低MCF-7細(xì)胞的增殖水平。(5)FCM法發(fā)現(xiàn)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞后能夠有效抑制MCF-7細(xì)胞中P2X7R的表達(dá),并且可以顯著降低MCF-7細(xì)胞增殖水平以及誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入晚期凋亡。
　　結(jié)論：乳腺癌病理組織的P2X7R的表達(dá)水平高于乳腺正常組織,同時(shí)與雌激素受體(ER+)呈正相關(guān)性,P2X7R-shRNA表達(dá)載體能有效地抑制乳腺癌細(xì)