洋橄欖素阻滯乳腺癌MCF-7細(xì)胞周期及誘導(dǎo)其凋亡作用機(jī)制的研究.pdf

1、目的：
　　本研究擬比較洋橄欖素對(duì)肺癌(A549)、乳腺癌（MCF-7、MDA-231）及肝癌(HepG-2)等不同腫瘤細(xì)胞的敏感性，研究洋橄欖素對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞周期及凋亡的影響，闡明洋橄欖素對(duì)乳腺癌細(xì)胞周期及凋亡下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白靶向調(diào)控，分析探討洋橄欖素抗乳腺癌的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子機(jī)制，為尋找乳腺癌藥物治療的切入點(diǎn)和治療靶點(diǎn)提供理論與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　1、采用MTT比色法檢測(cè)洋橄欖素對(duì)不同腫瘤細(xì)胞的增殖抑制

2、作用;
　　2、采用流式細(xì)胞儀觀察洋橄欖素處理乳腺癌(MCF-7)細(xì)胞24h后，對(duì)其周期及凋亡變化的影響;
　　3、采用Western blot法檢測(cè)洋橄欖素對(duì)周期調(diào)控蛋白CDK1、CyclinB1和細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2表達(dá)水平的影響;
　　4、進(jìn)一步采用Western blot法檢測(cè)洋橄欖素對(duì)MAPK及PI3K/AKt信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，初步闡明其抗乳腺癌MCF-7細(xì)胞的信號(hào)通路作用機(jī)制;

3、>　　5、相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制劑處理MCF-7細(xì)胞，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)MCF-7細(xì)胞凋亡變化情況，進(jìn)一步明確洋橄欖素抗乳腺癌MCF-7細(xì)胞作用機(jī)制。
　　結(jié)果：
　　1、不同濃度(0.25，0.5，0.75，1，1.5μM)的洋橄欖素處理不同的腫瘤細(xì)胞:肺癌(A549)、乳腺癌(MCF-7、MDA-231)及肝癌（HepG-2），24h MTT檢測(cè)結(jié)果顯示:洋橄欖素對(duì)MCF-7細(xì)胞的增殖抑制作用最明顯，且具有時(shí)間和劑量的依賴

4、性，因此我們選取了MCF-7細(xì)胞為本課題的研究對(duì)象。洋橄欖素處理MCF-7細(xì)胞24，48，72h的IC50分別是0.81，0.68，0.61μM。
　　2、通過流式細(xì)胞儀測(cè)定的細(xì)胞周期結(jié)果顯示:與對(duì)照相比，洋橄欖素(0.75μM、1μM)處理MCF-7細(xì)胞后，細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞含量基本不變，S期細(xì)胞含量逐漸減少，G2/M期細(xì)胞含量明顯增多，呈劑量依賴性。當(dāng)洋橄欖素為1μM濃度時(shí)，G2/M期細(xì)胞含量是24.6±8.9％，而對(duì)照組細(xì)

5、胞含量數(shù)是8.5±2.3％;當(dāng)洋橄欖素為1μM濃度時(shí)，G0/G1期細(xì)胞含量是60.1±7.6％，而對(duì)照組細(xì)胞含量數(shù)是63.5±5.0％。細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比洋橄欖素作用后，MCF-7細(xì)胞凋亡率明顯增加，且呈劑量依賴性。當(dāng)洋橄欖素濃度為0.75μM、1μM時(shí)，MCF-7細(xì)胞凋亡率分別為31.9±5.2％，41.1±4.6％。流式數(shù)據(jù)顯示:洋橄欖素具有阻滯MCF-7細(xì)胞于G2/M期及誘導(dǎo)其凋亡的作用。
　　3、Weste

6、rn blot檢測(cè)結(jié)果表明:洋橄欖素作用MCF-7細(xì)胞24h后，下調(diào)G2/M期相關(guān)蛋白CDK1、CyclinB1的表達(dá);上調(diào)促細(xì)胞凋亡蛋白Bax表達(dá)，下調(diào)抗細(xì)胞凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，且與上述流式結(jié)果相符。
　　4、進(jìn)一步用Western blot法檢測(cè)MAPK、PI3K/AKt信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的結(jié)果表明:洋橄欖素下調(diào)p-ERK的表達(dá)，上調(diào)p-p38的表達(dá)，而不影響p-JNK的表達(dá)水平;另外，洋橄欖素也可抑制PI3K/AKt

7、信號(hào)通路中p-AKt的表達(dá)。
　　5、與單獨(dú)用0.75μM洋橄欖素組對(duì)比，加入PI3K/AKt及MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白的抑制劑預(yù)處理組測(cè)細(xì)胞凋亡變化情況表明:與0.75μM洋橄欖素組（18.7±3.5％）相比，ERK抑制劑(U0126)+洋橄欖素組細(xì)胞凋亡率增加（34.0±5.1％），p38抑制劑(SB203580)+洋橄欖組細(xì)胞凋亡率減少（12.6±3.0％），JNK抑制劑(SP600125)+洋橄欖素組細(xì)胞凋亡率基本不變（1

8、7.8±1.7％），AKt抑制劑(LY294002)+洋橄欖素組細(xì)胞凋亡率明顯增加（36.4±11.3％）。
　　結(jié)論：
　　洋橄欖素能抑制乳腺癌細(xì)胞MCF-7的增殖，阻滯MCF-7細(xì)胞周期于G2/M期，誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡。其與改變細(xì)胞G2/M期相關(guān)的蛋白(CDK1、CyclinB1)及細(xì)胞凋亡相關(guān)的蛋白（Bax、Bcl-2）的表達(dá)有關(guān)。洋橄欖素介導(dǎo)MAPK及PI3K/AKt信號(hào)通路起到抗乳腺癌MCF-7細(xì)胞活性的作用。