氨氮、亞硝態(tài)氮對(duì)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)的影響.pdf

1、隨著農(nóng)業(yè)化肥，工業(yè)防腐劑的廣泛應(yīng)用，自然界水體和土壤中氨氮，硝態(tài)氮，亞硝態(tài)氮含量逐年增加。亞硝酸鹽是常見的亞硝態(tài)氮，硫酸銨是常用的化肥，近年來在環(huán)境中負(fù)荷不斷加大。與此同時(shí)，流行病學(xué)研究顯示，氨氮污染嚴(yán)重的地區(qū)癌的發(fā)病率和死亡率逐步增高，尤其是肺癌近年來最為嚴(yán)重。深入研究氨氮與肺癌的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系有非常重要的意義。
　　目的:選擇肺癌為研究對(duì)象，氨氮及亞硝酸鹽對(duì)于肺癌細(xì)胞演變的生物學(xué)作用。在模擬的腫瘤微環(huán)境中研究氨氮及亞硝態(tài)氮對(duì)于

2、肺癌細(xì)胞的侵襲作用所起的作用。為進(jìn)一步了解亞硝酸鹽和肺癌的關(guān)系補(bǔ)充依據(jù)。
　　方法:用小鼠成纖維細(xì)胞L929和小鼠肺癌細(xì)胞LLC細(xì)胞共培養(yǎng)，體外模擬腫瘤微環(huán)境，制作細(xì)胞模型。免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）表達(dá);以亞硝酸鈉代表亞硝態(tài)氮，以硫酸銨代表氨氮。體外細(xì)胞增殖指標(biāo)采用MTT細(xì)胞增殖活性;PI染色流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期;Hoechst33258熒光染色計(jì)數(shù)細(xì)胞分裂指數(shù);細(xì)胞遷移和侵襲能力判定采用劃痕實(shí)驗(yàn)和Tr

3、answell侵襲實(shí)驗(yàn)，結(jié)合細(xì)胞爬片細(xì)胞形態(tài)變化判定上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-to-mesenchymaltransition，EMT）的發(fā)生。免疫熒光法檢測(cè)活性氧的含量。
　　結(jié)果:MTT結(jié)果顯示:對(duì)LLC細(xì)胞，亞硝酸鈉、硫酸銨、亞硝酸鈉硫酸銨混合液有濃度依賴性增殖抑制作用(P＜0.05)，亞硝酸鈉在0.8mg·L-1-1.0mg·L-1，細(xì)胞增殖有小幅增加;硫酸銨濃度在1.0mg·L-1-1.8mg·L-1，細(xì)胞增殖

4、有小幅增加;亞硝酸鈉和硫酸銨混合液對(duì)細(xì)胞增殖抑制作用明顯比單純亞硝酸鈉組和硫酸銨組低(P＜0.05);對(duì)L929細(xì)胞，亞硝酸鈉在0.8mg·L-1-1.0mg·L-1濃度范圍內(nèi)，硫酸銨在1.0mg·L-1-1.8mg·L-1范圍內(nèi)對(duì)細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用;對(duì)LLC或L929細(xì)胞的促增殖作用，相同劑量，相同時(shí)間條件下，硫酸銨作用強(qiáng)于亞硝酸鈉（P＜0.05）;亞硝酸鈉或硫酸銨對(duì)L929細(xì)胞促增殖作用強(qiáng)于LLC（P＜0.05）。將L929和LLC

5、細(xì)胞共培養(yǎng)(L929-LLC)模擬腫瘤微環(huán)境，經(jīng)免疫組化法檢測(cè)到共培養(yǎng)體系中一些細(xì)胞的α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)表達(dá)呈陽性，證實(shí)這些細(xì)胞已轉(zhuǎn)化為腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞(carcinoma-associatedfibroblasts，CAFs）。經(jīng)MTT結(jié)果顯示對(duì)L929-LLC細(xì)胞，亞硝酸鈉在0.8mg·L-1-1.0mg·L-1，對(duì)細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用;硫酸銨濃度在1.0mg·L-1-1.8mg·L-1，48小時(shí)，對(duì)細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用

6、，亞硝酸鈉或硫酸銨對(duì)L929-LLC細(xì)胞促增殖作用強(qiáng)于單獨(dú)培養(yǎng)的LLC和L929細(xì)胞（P＜0.05）;亞硝酸鈉和硫酸銨混合液濃度在0.1mg·L-1-1.8mg·L-1對(duì)細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用，其中濃度在1.8mg·L-1時(shí)，對(duì)細(xì)胞增殖促進(jìn)作用最顯著(P＜0.05);1.8mg·L-1亞硝酸鈉硫酸銨混合溶液(1∶1)對(duì)L929-LLC細(xì)胞促增殖作用強(qiáng)于單獨(dú)用硫酸銨組，而硫酸銨組又強(qiáng)于單純亞硝酸鈉組(P＜0.05)。亞硝酸鈉、硫酸銨、亞硝酸鈉

7、硫酸銨混合液對(duì)細(xì)胞增殖無抑制作用。分別將0.8mg·L-1濃度的亞硝酸鈉、1.0mg·L-1濃度硫酸銨、1.8mg·L-1亞硝酸鈉和硫酸銨混合溶液加入L929-LLC中48小時(shí)，PI染色，流式細(xì)胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn):S期加G2期細(xì)胞所占比例分別為(9.13±1.54)％、(10.17±2.10)％、(16.32±1.13)％，與各自空白對(duì)照組相比，差異明顯(P＜0.05)，其中，亞硝酸鈉和硫酸銨混合溶液處理的L929-LLC細(xì)胞S期加G2期細(xì)胞

8、所占比例高于硫酸銨組，而硫酸銨組高于單純亞硝酸鈉組(P＜0.05);Hoechst33258熒光染色，顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞分裂指數(shù)發(fā)現(xiàn):細(xì)胞分裂指數(shù)分別為(13.41±4.17)％、(15.2±3.75)％、(18.78±4.91)％，與各自空白對(duì)照組相比，差異明顯(P＜0.05)，其中，亞硝酸鈉和硫酸銨混合溶液處理的L929-LLC細(xì)胞分裂指數(shù)高于硫酸銨組，而硫酸銨組又高于單純亞硝酸鈉組(P＜0.05);倒置顯微鏡下發(fā)現(xiàn):亞硝酸鈉和硫酸銨

9、混合溶液處理L929-LLC細(xì)胞48小時(shí)，大批細(xì)胞呈細(xì)長(zhǎng)的梭形，梭形細(xì)胞數(shù)量明顯比單純硫酸銨組多，單純亞硝酸鈉組梭形細(xì)胞數(shù)相對(duì)較少;劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:亞硝酸鈉和硫酸銨混合溶液處理的L929-LLC細(xì)胞劃痕愈合的相對(duì)距離高于硫酸銨組，而硫酸銨組又高于單純亞硝酸鈉組(P＜0.05);Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)顯示:穿過基底膜的細(xì)胞數(shù)個(gè)數(shù)分別為90±2.94，114±3.43，132±3.96，與各自空白對(duì)照組相比，差異明顯(P＜0.05

10、)。亞硝酸鈉和硫酸銨混合溶液處理的L929-LLC穿膜細(xì)胞數(shù)高于硫酸銨組，而硫酸銨組高于亞硝酸鈉組(P＜0.05)。免疫熒光檢測(cè)活性氧結(jié)果顯示:亞硝酸鈉組、硫酸銨組、亞硝酸鈉和硫酸銨混合溶液組都明顯高于空白對(duì)照組，亞硝酸鈉和硫酸銨混合溶液處理的L929-LLC熒光強(qiáng)度高于亞硝酸鈉組，而硫酸銨組高于亞硝酸鈉組(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.亞硝酸鈉和硫酸銨單獨(dú)應(yīng)用或混合應(yīng)用，對(duì)L929-LLC共培養(yǎng)細(xì)胞有促增殖作用，亞