烏頭湯配伍減毒及對Ra-HFLS PI3K-AKT信號通路調(diào)控的研究.pdf

1、研究背景與目的:
　　類風濕關節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以關節(jié)滑膜炎癥為主要表現(xiàn)的自身免疫性疾病。文獻記載，烏頭湯用于痹證的治療療效確切。烏頭湯記載在《金匱要略》，是東漢時代著名醫(yī)學家張仲景創(chuàng)制的一首名方，由川烏、麻黃、芍藥、黃芪、炙甘草五味藥材組成，具有溫經(jīng)祛寒，除濕止痛的功效，主治寒濕痹證。著名老中醫(yī)李可先生在原方基礎上加上黑豆及防風，創(chuàng)改良方，以達到制約制川烏毒性的目的，同時保持原方的藥效。

2、
　　本研究是在課題組前期已開展的配伍減毒實驗、譜效學研究和烏頭湯生物堿對人類風濕關節(jié)炎滑膜細胞(RA-HFLS)增殖影響研究的基礎上，進一步對烏頭湯的配伍減毒、以及烏頭湯生物堿抑制人類風濕關節(jié)炎滑膜細胞(HFLS)增殖的機制進行探究，為烏頭湯的臨床用藥以及進一步的開發(fā)提供科學依據(jù)。
　　方法:
　　1、烏頭湯配伍減毒研究
　　采用HPLS-ESI-MS技術分析生川烏單煎液、制川烏單煎液、金匱烏頭湯、李可改良之烏

3、頭湯中烏頭堿型生物堿類成分，比較炮制以及配伍對烏頭堿型生物堿成分的影響，同時，利用UPLC-MS/MS技術測定生川烏單煎液、制川烏單煎液、金匱烏頭湯、李可改良之烏頭湯中6種烏頭堿的含量，總結川烏減毒的規(guī)律。
　　2、烏頭湯中麻黃總生物堿對TNF-α誘導RA-HFLS PI3K/Akt信號通路的調(diào)節(jié)作用
　　利用體外培養(yǎng)HFLS，TNF-α誘導HFLS增殖模擬RA體內(nèi)環(huán)境，采用四甲基偶氮唑鹽法(MTT法)，比較烏頭湯不同生物堿

4、部位對HFLS的增殖抑制作用。設計3個給藥組進行實驗:烏頭湯總生物堿組、制川烏總生物堿組、麻黃總生物堿組，并對各組細胞增殖抑制率進行統(tǒng)計分析。
　　分析結果顯示，麻黃總生物堿對RA-HFLS增殖抑制作用效果最佳，因此，以麻黃總生物堿為研究對象，進一步探究麻黃總生物堿抑制RA-HFLS增殖的作用機制。通過ELISA法測定TNF-α誘導的RA-HFLS細胞培養(yǎng)上清發(fā)現(xiàn)，觀察麻黃總生物堿對RA-HFLS中TNF-α、IL-1β表達的影響

5、。同時利用Western Blot方法檢測不同濃度麻黃總生物堿對TNF-α誘導的RA-HFLS中非磷酸化及磷酸化的Akt和NF-κB蛋白表達的影響。
　　結果：
　　在烏頭湯配伍減毒研究部分，對比生川烏單煎液和制川烏單煎液中烏頭堿型生物堿成分以及6種烏頭堿的含量發(fā)現(xiàn)，藥材中所含的毒性較強雙酯型烏頭堿經(jīng)炮制后，水解成毒性較弱的單酯型烏頭堿，從而達到減毒的炮制效果;通過與制川烏單煎液對比，發(fā)現(xiàn)金匱烏頭湯和李可改良之烏頭湯配伍后，

6、已基本上不存在雙酯型烏頭堿水解減毒的作用，主要是單酯型烏頭堿的成分損失起到減毒的作用，而且李可改良之烏頭湯的配伍減毒效果要優(yōu)于金匱烏頭湯。
　　在烏頭湯中麻黃總生物堿對TNF-α誘導RA-HFLS PI3K/Akt信號通路的調(diào)節(jié)作用研究部分，體外細胞藥效篩選研究表明麻黃總生物堿對RA-HFLS增殖的抑制作用強于烏頭湯總生物堿和制川烏總生物堿。ELISA檢測結果顯示麻黃總生物堿能降低RA-HFLS中TNF-α、IL-1β表達水平，并

7、呈劑量依賴性。Western Blot方法分析顯示不同劑量的麻黃總生物堿均能下調(diào)RA-HFLS磷酸化的Akt和NF-κB蛋白表達，并呈劑量依賴性，但對RA-HFLS中非磷酸化的Akt和NF-κB蛋白表達則無抑制作用。
　　結論：
　　烏頭湯在炮制過程中雙酯型烏頭堿水解成單酯型烏頭堿的基礎上，通過配伍來進一步減少單酯型烏頭生物堿的成分，從而起到減毒的效果，同時在配伍過程中雙酯型烏頭堿水解減毒發(fā)揮的作用非常微弱。
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