hSHIP負(fù)調(diào)PI3K-AKt信號(hào)通路對(duì)HeLa細(xì)胞增殖與凋亡的影響.pdf

1、背景：hSHIP(Human SH2 domain-containing inositol5-phosphatase，人含SH2結(jié)構(gòu)域肌醇磷酸酯酶)屬于肌醇5’磷酸酯酶家族，主要在造血細(xì)胞中表達(dá)。研究顯示， SHIP能通過PI3K/Akt信號(hào)通路對(duì)造血細(xì)胞增殖、存活及終端細(xì)胞活化起到負(fù)調(diào)節(jié)作用。本文主要探究hSHIP是否誘導(dǎo)PI3K/Akt信號(hào)通路異常活化的非造血腫瘤細(xì)胞(HeLa)的細(xì)胞周期發(fā)生阻滯作用及凋亡。 方法：以人外周

2、血單個(gè)核細(xì)胞總RNA為模板，RT-PCR擴(kuò)增hSHIP基因的全長cDNA編碼區(qū)序列，將其插入pcDNA3.1-GFP中，構(gòu)建pcDNA3.1-GFP-hSHIP真核表達(dá)載體：用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，經(jīng)G418篩選，單克隆化細(xì)胞培養(yǎng)及采用熒光顯微鏡觀察和Western blotting進(jìn)一步鑒定以獲得穩(wěn)定表達(dá)目的基因的HeLa細(xì)胞株：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期：caspase-3活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)及Hoechst33258/PI雙染色法分析細(xì)胞

3、凋亡；MTT法及裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖與存活：半定量RT-PCR及Western blotting檢測(cè)Akt的表達(dá)情況及ELISA法檢測(cè)Akt磷酸化水平。 結(jié)果：成功構(gòu)建TpcDNA3.1-GFP-hSHIP真核表達(dá)載體，并成功建立了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞株(HeLa/hSHIP-GFP，HeLa/GFP)。與對(duì)照組(HeLa/GFP)相比，細(xì)胞處于S期的比例從27.3±4.50％上升到47.2±47.78％(P<0.05)

4、，G2/M期從14.5±1.91％減少到2.6±0.71％(P<0.05)，顯示hSHIP將HeLa細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯于S期；Hoechst33258/PI和caspase-3活性檢測(cè)顯示了hSHIP對(duì)HeLa細(xì)胞起促凋亡作用；MTT法顯示96小時(shí)后hSHIP對(duì)HeLa細(xì)胞的生長抑制率高達(dá)80.91％(P<0.05)，裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)顯示HeLa/hSHIP-GFP細(xì)胞生長顯著減緩，瘤體重量比為255.0±50mg vs117.5±35