間硝苯地平同系物的合成及其腸道吸收預測研究.pdf

1、目的：以目前國際公認的預測藥物腸道吸收的Caco-2細胞為模型，研究間硝苯地平及其同系物在Caco-2細胞上的攝取動力學，對該同系物進行腸道吸收篩選，確定出候選藥物，為該類藥物的研發(fā)提供可靠的依據(jù)。 方法：1.采用改進的方法合成間硝苯地平及其同系物。在間硝苯地平的合成中采用一步法進行合成，應用濃氨水作為反應中的氨源，進一步優(yōu)化合成路線。在MN9202合成中，首先將合成的間硝苯地平在堿性條件下水解而生成中間體，然后利用中間體進行酯

2、化反應，從而生成MN9202。合成的化合物運用HPLC方法進行檢測，確定為目標化合物并且達到純度要求。2.采用HPLC方法建立生物樣本中間硝苯地平及其同系物在的檢測方法。3.培養(yǎng)成熟的Caco-2細胞分別與100μM的間硝苯地平、MN9201、MN9202、MN9203孵育5、10、20、30、40、60min，采用HPLC檢測細胞內藥物濃度，觀察細胞對藥物的攝取與時間之間的關系。4.培養(yǎng)成熟的Caco-2細胞分別與50、100、200

3、、500、1000μM間硝苯地平、MN9201、MN9202、MN9203孵育一定的時間，采用HPLC檢測細胞內藥物濃度，觀察細胞對藥物的攝取與藥物濃度之間的關系。5.用不同濃度的P-糖蛋白抑制劑(維拉帕米的濃度為10、25、100μM，環(huán)孢菌素A的濃度為5、20、50μM)與Caco-2細胞孵育30min，除去抑制劑，加入100μM間硝苯地平、MN9201、MN9202、MN9203孵育一定時間，采用HPLC檢測細胞內藥物濃度，觀察P

4、-糖蛋白抑制劑對藥物攝取量的影響。 結果：1.合成的m-Nif、MN9202在選定的流動相條件下與對照品具有相同的出峰時間且峰形良好，純度大于95％，合成的化合物在237nm和350nm處均具有特征吸收峰。2.由于間硝苯地平及其同系物在237nm處的紫外吸收峰較350nm處強2-3倍，加之細胞樣品內源性干擾少，因此選擇237nm作為檢測波長；利用堿化液處理樣品，選用乙醚對生物樣品中的藥物進行提取，降低了內源性物質的干擾，提高了藥

5、物的提取率以及檢測的特異性和靈敏度。檢測m-Nif和MN9201的流動相組成為：乙腈/水=75/25，流速為1mL/min，檢測波長237nm；檢測MN9202和MN9203的流動相組成為：乙腈/水=82/18，流速為1mL/min，檢測波長237nm。檢測m-Nif的工作曲線回歸方程為Y=0.1319+0.0048X(r=0.9998,n=7)，線性范圍為20-1000ng/mL，其低、中、高三個濃度的日間RSD分別為8.52％、6.

6、70％、8.61％，日內RSD為1.55％、2.37％、2.98％(n=7)。檢測MN9201的工作曲線回歸方程為Y=-0.0085+0.0044X(r=0.9998,n=7)，線性范圍為20-1000ng/mL，其低、中、高三個濃度的日間RSD分別為6.52％、9.70％、8.61％，日內RSD為3.63％、7.45％、10.01％(n=7)。檢測MN9202的工作曲線回歸方程為Y=0.0592+0.0048X(r=0.9999,n=

7、7)，線性范圍為20-1000ng/mL，其低、中、高三個濃度的日間RSD分別為10.97％、13.25％、14.23％，日內RSD分別為5.09％、7.62％、7.22％(n=7)。檢測MN9203的工作曲線回歸方程為Y=0.1654+0.0048X(r=0.9996,n=7)，線性范圍為40-1000ng/mL，其低、中、高三個濃度的日間RSD分別為14.65％、7.88％、9.89％(n=7)，日內RSD為9.55％、5.78％、

8、6.01％(n=7)。3.Caco-2細胞對間硝苯地平、MN9202、MN9201的攝取，在孵育時間分別為20、30、40分鐘時達到最大，攝取藥物的最大量分別為4250±9、25855±517、47013±623pmoL/mg蛋白；而細胞對MN9203的攝取量在孵育60min后仍有上升的趨勢。4Caco-2細胞對間硝苯地平、MN9201、MN9202的攝取在藥物濃度為500uM時達到最大，而細胞對MN9203的攝取隨著濃度的增加呈增加的

9、趨勢，在實驗濃度范圍內未見最大值出現(xiàn)。間硝苯地平的最大攝取量為5772±395pmoL/mg蛋白，MN9201達到的最大攝取量為1539×103±13133pmoL/mg蛋白，MN9202達到的最大攝取量為7615±83pmoL/mg蛋白。5.不同濃度P-糖蛋白抑制劑對該類藥物攝取的影響各不相同。P-糖蛋白抑制劑對間硝苯地平的攝取沒有明顯的影響。應用低、中、高濃度維拉帕米后，細胞對MN9201和MN9202的攝取量沒有顯著的增加(p＞0

10、.05)；低濃度的維拉帕米對MN9203的攝取量沒有顯著影響(p＞0.05)，但中濃度和高濃度的維拉帕米可使細胞對MN9203的攝取顯著增加(p＜0.05)。用低、中、高三個濃度的環(huán)孢菌素A處理之后，細胞對MN9201的攝取量明顯增加(p＜0.05)；中濃度和高濃度的環(huán)孢菌素A可使細胞對MN9202的攝取量顯著增加(p＜0.05)；低濃度的環(huán)孢菌素A處理后，細胞對MN9203的攝取呈現(xiàn)明顯上升的趨勢，而中濃度和高濃度組對MN9203的攝

11、取卻沒有明顯影響(p＞0.05)。應用P-糖蛋白抑制劑之后，除間硝苯地平外，細胞對MN9201、MN9202、MN9203的攝取量有不同程度的增加。 結論：1.改良之后的合成路線能夠合成出具有較高純度的間硝苯地平及MN9202同系物，且縮短了反應時間。2.本文建立的生物樣品中二氫吡啶類藥物的HPLC檢測方法，具有準確、靈敏、可靠、簡便的特點。3.Caco-2細胞對間硝苯地平同系物的攝取存在時間依賴、濃度依賴關系。四種藥物中，細胞