馬鈴薯再生體系的建立及HAL1基因遺傳轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、鹽堿地是巨大的潛在資源，綠化鹽堿地是擴(kuò)大耕地面積，進(jìn)一步發(fā)展農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、改善生態(tài)環(huán)境的重要措施。利用基因工程手段培育能在鹽堿地上種植的植物，是利用鹽堿地的一條經(jīng)濟(jì)而有效的途徑。HAL1基因是釀酒酵母中的重要耐鹽因子，其表達(dá)參與調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)離子濃度。盡管HAL1基因本身不是轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，但在鹽脅迫下能與ENA1基因協(xié)同作用促進(jìn)Na<'+>外排，與其它轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)協(xié)同作用增加K<'+>的吸收，保持細(xì)胞內(nèi)低的Na<'+>/K<'+>比，以減輕Na<'+>

2、毒害，因而在植物耐鹽基因工程上具有很大的潛力。 本研究用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤(pán)法將HAL1基因轉(zhuǎn)入馬鈴薯，探索農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化條件及其影響因素，并對(duì)轉(zhuǎn)基因馬鈴薯的耐鹽性進(jìn)行評(píng)價(jià)。主要研究結(jié)果如下： 1.以克新12號(hào)、克新13號(hào)、東農(nóng)303和早大白4種馬鈴薯試管苗莖段為材料，進(jìn)行了各品種莖段的離體再生研究。結(jié)果表明克新13號(hào)和克新12號(hào)的最適愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-Bh2mg/L+2，4-Dlmg/L，東農(nóng)303為MS

3、+6-Bh2mg/L+2，4-D0.5mg/L，早大自為：Ms+6-BA 2mg/L+2，4-D0.5mg/L，愈傷誘導(dǎo)率分別為100％，100％，100％和90％?？诵?3號(hào)愈傷組織分化的最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA 4.Omg/L+NAA0.1mg/L+GA<,3> 1.0mg/L，克新12號(hào)為MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L+GA<,3>1.0mg/L，東農(nóng)303為MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.1mg/L

4、+GA<,3>1，5mg/L，早大白為MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L+GA<,3>1.0mg/L，分化率分別為80％，90％，100％，76.7％。根據(jù)以上試驗(yàn)結(jié)果，確定東農(nóng)303為下一步遺傳轉(zhuǎn)化的受體材料。 2.以東農(nóng)303試管苗莖段為材料，建立了較為理想的再生體系。以MS+6-Bh2mg/L+2，4-D0.5mg/L為愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基，以MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.1mg/L+GA<,3>1

5、.5mg/L為愈傷組織分化培養(yǎng)基。經(jīng)Kan篩選試驗(yàn)，以60 mg/L和75mg/LKan分別作為愈傷組織誘導(dǎo)和愈傷組織分化的篩選濃度。以60mg/LKan作為兩者轉(zhuǎn)化植株生根時(shí)的篩選濃度。 3.優(yōu)化了HAL1基因轉(zhuǎn)化馬鈴薯遺傳體系。取3w苗齡的東農(nóng)303無(wú)菌試管苗，進(jìn)行2d預(yù)培養(yǎng)，用處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，OD<,600>為0.6時(shí)的攜帶目的基因的LRA4404農(nóng)桿菌菌液侵染時(shí)間為5min來(lái)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。外植體與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)2d后，用滅菌蒸

6、餾水沖洗4～5次，置于含有250 mg/L Cb的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，獲得了抗Kan的抗性植株。 4．經(jīng)PCR擴(kuò)增檢測(cè)，有5株轉(zhuǎn)化植株能夠獲得約900 bp的特異性擴(kuò)增譜帶，初步證明．HAL 1基因已整合到馬鈴薯基因組中。耐鹽試驗(yàn)表明，在檢測(cè)的轉(zhuǎn)化植株中有90.9％的轉(zhuǎn)基因植株在0.8％～0.9％NaCl的生根培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好，45.6％的轉(zhuǎn)基因植株耐鹽能力可高達(dá)1.0％，而對(duì)照馬鈴薯植株只在低于0.7％NaCl的生根培養(yǎng)基中生根。