膜聯(lián)蛋白A2及微管對(duì)大鼠背根神經(jīng)節(jié)IRPV4的調(diào)控.pdf

1、背景：
　　 神經(jīng)病理性疼痛是一種由中樞或外周神經(jīng)病變或功能障礙引起的疼痛綜合征，嚴(yán)重影響病人的生活質(zhì)量。背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion，DRG)神經(jīng)元是初級(jí)感覺(jué)神經(jīng)元，負(fù)責(zé)將外界疼痛刺激轉(zhuǎn)換為內(nèi)在神經(jīng)沖動(dòng)并將其傳導(dǎo)至脊髓。目前針對(duì)周?chē)陨窠?jīng)病理性疼痛的一些研究集中在DRG神經(jīng)元的瞬時(shí)感受器電位離子通道家族(Transient receptor potential channel，TRP channel)及

2、其功能上。作為T(mén)RP通道家族成員之一，瞬時(shí)感受器電位離子通道-香草素亞型4(Transient receptor potential vanilloid4，TRPV4，also known aS OTRPC4，VRL-2，VR-OAC，and TRP12)是一種非選擇性陽(yáng)離子通道，具有Ca2+子通透性，參與DRG神經(jīng)元介導(dǎo)的疼痛信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程。Alessandri-Haber等發(fā)現(xiàn)沉默TRPV4通道蛋白會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞滲透壓調(diào)節(jié)異常及對(duì)低滲性傷

3、害性刺激反應(yīng)能力下降。此外，TRPV4在炎性物質(zhì)導(dǎo)致的DRG機(jī)械痛覺(jué)過(guò)敏過(guò)程中起重要作用。在長(zhǎng)春新堿、酒精中毒、糖尿病及人類(lèi)免疫缺陷病毒等因素導(dǎo)致的外周神經(jīng)病變動(dòng)物疼痛模型中，注射TRPV4反義寡核苷酸會(huì)使動(dòng)物的機(jī)械痛覺(jué)過(guò)敏降低。因此，了解DRG神經(jīng)元TRPV4通道活動(dòng)的分子機(jī)制對(duì)進(jìn)一步理解疼痛發(fā)生發(fā)展有重要幫助。然而目前該分子機(jī)制，尤其是調(diào)節(jié)TRPV4表達(dá)及功能的機(jī)制，還并不完全清楚。
　　 研究表明某些細(xì)胞上TRPV4的基因

4、表達(dá)和功能變化受一些輔助蛋白的調(diào)節(jié)，如神經(jīng)元蛋白激酶C酪蛋白激酶底物3(protein kinase C and casein kinasesubstrate in neurons protein3，PACSIN3)、三磷酸肌醇(1，4，5)受體3(inositol1，4，5-trisphosphate receptor type3，IP3R3)及肌動(dòng)蛋白，但DRG神經(jīng)元TRPV4受何種因素調(diào)節(jié)還未有確切的理解。動(dòng)物DRG的慢性壓迫(c

5、hronic compression ofDRG，CCD)可以模擬臨床上椎管狹窄和椎間盤(pán)突出等疾病引起的神經(jīng)根受壓癥狀，是一種典型的神經(jīng)病理性疼痛模型。我們前期的研究顯示TRPV4參與介導(dǎo)CCD誘導(dǎo)的機(jī)械痛及熱痛覺(jué)過(guò)敏。進(jìn)一步的蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)CCD會(huì)導(dǎo)致15種蛋白的表達(dá)變化，膜聯(lián)蛋白A2(Annexin A2)作為其中的一種蛋白其表達(dá)顯著上調(diào)。膜聯(lián)蛋白家族(Annexins)是一類(lèi)主要分布在細(xì)胞膜胞質(zhì)面的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，

6、并在許多生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用包括離子通道的調(diào)節(jié)。研究證實(shí)Annexin A2通過(guò)與TRPV5/V6形成功能性復(fù)合物而參與TRPV5/V6的膜轉(zhuǎn)運(yùn)。然而，AnnexinA2是否能夠與TRPV4相互作用并修飾其功能和或表達(dá)尚未報(bào)道。
　　 在本實(shí)驗(yàn)中，我們利用免疫細(xì)胞化學(xué)和免疫共沉淀技術(shù)研究DRG神經(jīng)元Annexin A2和TRPV4兩蛋白間的相互作用。通過(guò)實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(real time reverse trans

7、cription-polymerase chain reaction，Real Time RT-PCR)、蛋白免疫印跡法及Ca2+熒光成像技術(shù)進(jìn)一步研究Annexin A2對(duì)TRPV4功能及表達(dá)方面的調(diào)節(jié)作用。
　　 目的：
　　 研究膜聯(lián)蛋白A2對(duì)大鼠DRG神經(jīng)元TRPV4的調(diào)控。
　　 方法：
　　 1.DRG神經(jīng)元培養(yǎng)
　　 取新生1天Wistar大乳鼠L2-L6的DRG，1mg/ml的膠原

8、酶與0.25％的胰酶37℃水浴箱消化50分鐘，加入10％血清終止消化。應(yīng)用吸管輕柔反復(fù)吹打至細(xì)胞懸液。200目濾網(wǎng)過(guò)濾去除未分散的組織塊。在含2％B27和1％神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)的NeurobaSal基礎(chǔ)培養(yǎng)液中培養(yǎng)。每2天更換培養(yǎng)基1次，培養(yǎng)第4天的DRG神經(jīng)元用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　 2.免疫細(xì)胞化學(xué)
　　 DRG神經(jīng)元培養(yǎng)4天后，冷丙酮-20℃固定細(xì)胞10分鐘，加入2％牛血清白蛋白(bovine serum albu

9、min，BSA)室溫封閉1小時(shí)，TRPV4(5ug/ml)與AnnexinA2(20ug/ml)一抗4℃孵育過(guò)夜。次日，加入帶有熒光標(biāo)記的相應(yīng)二抗室溫孵育1小時(shí)。細(xì)胞核使用DAPI染色2分鐘。封片，熒光顯微鏡下觀察TRPV4與Annexin A2在DRG神經(jīng)元的定位區(qū)域。
　　 3.免疫共沉淀
　　 收集DRG神經(jīng)元，加入細(xì)胞裂解液(含蛋白酶抑制劑)冰上裂解30分鐘。4℃14000g離心10分鐘，轉(zhuǎn)移上清(總蛋白)至新E

10、P管?？偟鞍字屑尤隤roteinA+G agarose，4℃搖晃30分鐘以去除非特異性雜蛋白。4℃14000g離心10分鐘，轉(zhuǎn)移上清至新EP管以去除ProteinA+G agarose。總蛋白中加入抗體4℃水平緩慢搖晃孵育過(guò)夜。次日加入ProteinA+G agarose，4℃水平緩慢搖晃孵育2小時(shí)。4℃3000g離心5分鐘，將proteinA+G agarose離心至管底。去掉上清，收集管底agarose-抗原抗體復(fù)合物，預(yù)冷PBS洗

11、5遍。加入上樣緩沖液重懸agarose-抗原抗體復(fù)合物，95℃煮沸5分鐘以游離抗體、瓊脂糖珠及蛋白。Western blot分析。
　　 4.AnnexinA2 siRNA干擾
　　 將DRG神經(jīng)元以1×105/ml的密度接種在96孔板上，培養(yǎng)4天后加入100nmol/L的Accell Annexin A2 siRNA l ul+97ul Accell delivery media+2％B272ul，培養(yǎng)72小時(shí)后提取R

12、NA與蛋白檢測(cè)Annexin A2及TRPV4mRNA及蛋白表達(dá)情況以檢驗(yàn)Annexin A2對(duì)TRPV4表達(dá)的調(diào)節(jié)作用，同時(shí)進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i的測(cè)量以觀察Annexin A2對(duì)TRPV4的功能調(diào)節(jié)作用。
　　 5.實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)
　　 從各組DRG神經(jīng)元中提取RNA，實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)Annexin A2及TRPV4 mRNA表達(dá)的變化。
　　 6.Western blotting檢測(cè)

13、r>　　 從各組DRG神經(jīng)元中提取蛋白質(zhì)，Western blotting檢測(cè)Annexin A2及TRPV4蛋白表達(dá)的變化。
　　 7.Ca2+成像實(shí)驗(yàn)
　　 Ca2+熒光探針(Fluo-3/acetoxymethyl ester，F(xiàn)luo-3/AM)從-20℃冰箱中取出，室溫下復(fù)溫，應(yīng)用含有0.02％pluronicF127的等滲溶液將其配制成終濃度5umol/L。DRG神經(jīng)元PBS沖洗1次后加入Fluo-3/AM

14、，室溫下負(fù)載30分鐘，負(fù)載過(guò)程中可輕輕搖晃促進(jìn)染色，然后PBS沖洗2次。將孵育完的DRG神經(jīng)元放在LCSM的載物臺(tái)上，488nm激光激發(fā)Fluo-3，觀察細(xì)胞內(nèi)Ca2+熒光強(qiáng)度的變化。實(shí)驗(yàn)應(yīng)在室溫下(<24℃)進(jìn)行，且在給予藥物刺激之前，應(yīng)先測(cè)量細(xì)胞內(nèi)Ca2+熒光強(qiáng)度至少30秒作為基礎(chǔ)值。然后應(yīng)用TRPV4的激活劑4a-phorbol12，13-didecanoate(4α-PDD，10umol/L)刺激3分鐘，觀察施加藥物前后熒光強(qiáng)度

15、變化。
　　 結(jié)果：
　　 1.免疫熒光檢測(cè)Annexin A2與TPRV4在DRG神經(jīng)元的定位區(qū)域
　　 Annexin A2與TRPV4在DRG神經(jīng)元存在部分共定位區(qū)域包括細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)。
　　 2.免疫共沉淀檢測(cè)Annexin A2與TPRV4間的相互作用
　　 提取的DRG神經(jīng)元總蛋白，經(jīng)anti-TRPV4抗體和proteinA+G agarose共沉淀后，用anti-Annexin A

16、2抗體行western blot可檢測(cè)到沉淀蛋白中的Annexin-A2(39kD)；經(jīng)anti-AnnexinA2抗體和proteinA+G agarose共沉淀后，用anti-TRPV4抗體行western blot能檢測(cè)到沉淀蛋白中的TRPV4(98kD)。上述結(jié)果提示Annexin A2與TRPV4通道蛋白之間存在某種關(guān)聯(lián)。
　　 3.RT-PCR測(cè)量干擾Annexin A2后AnnexinA2及TRPV4的mRNA變化

17、
　　 AnnexinA2：干擾AnnexinA2之后，干擾組AnnexinA2的mRNA表達(dá)降低，與正常對(duì)照組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 TRPV4：干擾Annexin A2之后，干擾組TRPV4的mRNA表達(dá)降低，但與正常對(duì)照組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　 4.Western blot測(cè)量干擾AnnexinA2后AnnexinA2及TRPV4的蛋白變化
　　 An

18、nexinA2：干擾AnnexinA2之后，干擾組AnnexinA2的蛋白表達(dá)降低，與正常對(duì)照組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 TRPV4：干擾AnnexinA2之后，干擾組TRPV4的蛋白表達(dá)降低，但與正常對(duì)照組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　 5.AnnexinA2的下調(diào)對(duì)TRPV4介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流的影響
　　 與對(duì)照組比較，干擾AnnexinA2可以明顯降低DRG神經(jīng)元內(nèi)4α