大鼠背根神經(jīng)節(jié)細胞質(zhì)膜蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、細胞質(zhì)膜(plasma membrane，PM)是所有細胞的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。質(zhì)膜蛋白質(zhì)執(zhí)行細胞與外界環(huán)境以及細胞與細胞之間的物質(zhì)交換、能量轉(zhuǎn)換和信號傳遞等功能。在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的藥物靶標中，大約有2/3是質(zhì)膜蛋白質(zhì)。因此，細胞質(zhì)膜蛋白質(zhì)組學(xué)研究具有重要的理論意義和應(yīng)用前景。然而，盡管近年來蛋白質(zhì)化學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)取得了很大的發(fā)展，但膜蛋白尤其是整合膜蛋白的分析仍然是一個巨大的挑戰(zhàn)，這是因為大多數(shù)膜蛋白質(zhì)不僅豐度低，而且由于疏水性強而溶解性差和

2、易于聚集沉淀，給蛋白質(zhì)的提取、酶解和鑒定帶來了很多困難，因此質(zhì)膜蛋白質(zhì)組學(xué)研究成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的難點。
　　 背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion，DRG)細胞是一種初級感覺神經(jīng)元，能傳導(dǎo)觸覺、痛覺、溫覺等神經(jīng)沖動。它們溝通脊髓與機體內(nèi)外環(huán)境的聯(lián)系，不僅傳輸和調(diào)節(jié)機體的各種感覺，而且還具有接受和傳遞機體各種傷害性感受的功能，因而在神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生與維持中起著重要的作用。開展DRG細胞膜蛋白的研究具有重要意

3、義，將為探討神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生機制、疾病的診斷和新藥開發(fā)將提供重要的理論基礎(chǔ)。由于大鼠DRG神經(jīng)組織體積較小而質(zhì)膜蛋白質(zhì)又大多具有低豐度和強疏水性的特點，所以在樣品的采集、溶解和蛋白質(zhì)鑒定等方面給DRG細胞質(zhì)膜蛋白質(zhì)組學(xué)研究帶來了更大的挑戰(zhàn)。
　　 為了從少量DRG細胞樣品中綜合性分析鑒定質(zhì)膜蛋白質(zhì)，本研究采用了差速離心結(jié)合雙水相法富集大鼠DRG質(zhì)膜的策略。Westernblotting結(jié)果顯示經(jīng)過這種富集策略處理的樣品中質(zhì)膜相

4、對濃度是差速離心后的2.3倍，是粗勻漿樣品的15倍。鑒于傳統(tǒng)的二維凝膠電泳不適合膜蛋白質(zhì)的分離，所以采用了SDS—PAGE來分離DRG質(zhì)膜蛋白質(zhì)樣品。分離后的樣品經(jīng)過trypsin酶解，CapLC—MS/MS鑒定和生物信息學(xué)分析。通過IPI數(shù)據(jù)庫的搜索，共得到了729個非冗余蛋白質(zhì)，其中547個有GO注釋信息，159(21.8％)個為質(zhì)膜蛋白質(zhì)。
　　 為了更好地鑒定DRG細胞質(zhì)膜上的蛋白質(zhì)尤其是低豐度蛋質(zhì)，隨后的研究中，在DR

5、G質(zhì)膜的雙水相富集后增加了高鹽高pH洗滌的步驟和Shotgun消化策略。本次研究共鑒定了954個蛋白質(zhì)，通過基于SDS—PAGE和Shotgun消化的策略分別鑒定了其中的620個和334個蛋白質(zhì)。在954個鑒定的蛋白質(zhì)中，有205個蛋白質(zhì)明確定位在質(zhì)膜。這些質(zhì)膜蛋白質(zhì)包括細胞結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)(22.8％)，信號和受體蛋白質(zhì)(25.7％)，離子通道和轉(zhuǎn)運蛋白質(zhì)(24.3％)，酶(8.3％)，細胞黏附因子(12.1％)以及一些具有其它功能的蛋白質(zhì)

6、(6.8％)。更多的低豐度的質(zhì)膜蛋白質(zhì)(包括離子通道蛋白和受體蛋白)得到了鑒定，如chloride intracellμLar channel protein 4(IPI00208249)，Sodium channel(IPI00326646)，Isoform 2 of sigma 1—type opioidreceptor(IPI00202168)等。這些研究有助于我們加深對DRG細胞質(zhì)膜蛋白質(zhì)在細胞與外界環(huán)境進行物質(zhì)和能量交換、信號