MicroRNA-133b在食管鱗狀細胞癌中的表達及調控.pdf

1、研究背景及目的:
　　食管癌(esophagealcancer，EC)是最常見消化道惡性腫瘤之一，發(fā)病率及死亡率分別位居所有惡性腫瘤中的第八位和第六位，主要病理類型分有鱗狀細胞癌（esophagealsquamouscellcarcinomaESCC）和腺癌(esophagealadenocarcinoma，EAC)兩大類，其中絕大部分為ESCC;我國是EC發(fā)病率和死亡率最高的國家之一，其發(fā)病率位居惡性腫瘤的第4位。由于EC明確診

2、斷時很多病例都處于局部晚期或淋巴結轉移，同時治療上缺乏靶向性，因此，目前EC預后效果仍舊不佳，術后總的5年生存率僅10-20％。更好的闡明EC的生物學行為，了解其發(fā)病機制對發(fā)展高效、特異性強的診斷方法和治療策略及提高EC術后生存具有重要意義。
　　微小RNA(miRNA)是一種長約21-25核苷酸的非編碼單鏈內源性RNA分子，進化上高度保守，主要通過轉錄后及翻譯水平負性調控基因表達，在機體生長發(fā)育、細胞分化增殖、細胞凋亡、激素分泌

3、和腫瘤形成等多個環(huán)節(jié)中起著重要的作用。近來，越來越多研究證明，miRNA的生成及功能異常與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關，在腫瘤發(fā)生過程中類似癌基因或抑癌基因。
　　研究證據提示miRNA參與了食管癌的發(fā)生、發(fā)展等病理過程，但具體作用機制仍舊未完全闡述清楚。因此，進一步研究食管癌中miRNA表達譜及對異常表達miRNAs進行功能分析有助于揭示食管癌發(fā)病新機制，同時為食管癌早期診斷、預后判斷及新的治療策略提供思路。
　　本課

4、題從研究食管鱗癌miRNAs表達譜著手，分析異常表達的miRNA在食管鱗癌中可能的作用機制。研究首先擬采用生物基因芯片分析并比較食管鱗狀細胞癌與正常食管鱗狀上皮粘膜miRNAs表達譜差異，篩選并驗證食管鱗狀細胞癌中相關特異的、異常表達的miRNAs，并確定其靶基因;進而，研究食管鱗癌異常表達的miRNAs及其靶基因在食管鱗癌發(fā)生、發(fā)展中的作用機制、以及可能的治療潛力。本課題研究提示了異常表達的miRNAs在食管鱗狀細胞癌發(fā)生、發(fā)展中扮演

5、了重要角色，也為食管鱗狀細胞癌早期診斷和預后判斷及靶向治療提供理論據。
　　第一部分食管鱗狀細胞癌中特異miRNAs鑒定
　　目的:
　　分析比較食管鱗狀細胞癌中miRNAs表達譜，篩選并驗證食管鱗癌相關、特異性的miRNAs。
　　方法:
　　利用TaqManMicroRNAArray生物芯片檢測并比較13對食管鱗癌及癌旁正常粘膜組織標本的miRNAs表達譜，篩選出ESCC中異常表達的miRNAs;通過分

6、析比較并結合文獻報道，從31個候選miRNAs中選定了10個進行初步分析，運用實時定量PCR(Real-timequantitativePCR)方法在20配對ESCC及癌旁組織標本中初步驗證了miR-21，miR-135b，miR-133b等3個表達異常的miRNAs;在50對ESCC及癌旁組織標本中進一步驗證上述3個異常癌表達miRNAs的表達水平，確認與ESCC組織相關特異的miRNAs。
　　結果:
　　1，通過生物芯

7、片，發(fā)現食管鱗癌組織中31個miRNAs表達異常。
　　2，利用qRT-PCR技術，在配對大樣本食管鱗癌和癌旁正常粘膜組織篩選并驗證，確定miR-21，miR-135b，miR-133b是ESCC相關的miRNAs。
　　結論:
　　miR-21,miR-135b，miR-133b是ESCC相關、特異的miRNAs。
　　第二部分miRNA-133b靶基因的預測及驗證
　　目的:
　　預測并確認miR

8、-133b下游靶基因。
　　方法:
　　運用生物信息學方法并結合文獻分析，從MiRbase、Targetscans及PicTar等靶基因預測數據信息庫中預測，篩選出與腫瘤密切相關的基因作為miR-133b在ESCC中候選靶基因;然后，在40對配對ESCC及癌旁正常粘膜組織中，運用qRT-PCR、蛋白印記法(WesternBlot)及免疫組織化學(Immunohistochemistry，IHC)等方法檢測候選基因的表達水平，

9、運用qRT-PCR檢測miR-133b表達水平，并比較miR-133b與候選基因表達水平的相關性，確定miR-133b下游靶基因。
　　結果:
　　1，通過miRNAs數據庫預測并結合文獻分析，預測LASP1、CDKN2AIP及BCL2L2可能是miR-133b的靶基因;
　　2，運用qRT-PCR、WestemBlot方法分析3個候選靶基因與miR-133b的關系，在ESCC組織中，我們發(fā)現miR-133b表達水平下

10、調，而LASP1在mRNA及蛋白水平表達均上調，兩者表達水平呈明顯的負相關（相關系數=-0.499，p=0.011）;而其他兩個基因與miR-133b表達水平無相關性;免疫組化揭示LASP1在食管鱗癌組織的細胞質及細胞核中均有表達。
　　結論:
　　LASP1為miR-133b的下游靶基因。
　　第三部分miRNA-133b及LASP1在食管鱗狀細胞癌發(fā)病中作用機制探討
　　目的:
　　揭示miR-133b

11、及LASP1在食管鱗狀細胞癌發(fā)生、發(fā)展中可能作用機制。
　　方法:
　　體外培養(yǎng)食管鱗狀細胞癌細胞株ECA109、KYSE510，運用基因獲得和/或缺失功能研究(gain/loss-of-function)技術，瞬時傳染miR-133b-mimic及siRNA-LASP1后，運用qRT-PCR方法檢測miR-133b表達水平變化，運用qRT-PCR、WesternBlot等方法LASP1的表達水平變化;同時運用MTTassa

12、y方法檢測細胞增殖;AnnexinV-FITCassay方法檢查對細胞凋亡的影響;Millcell實驗檢測細胞侵襲能力和遷移能力。
　　結果:
　　1，在ECA10、KYSE510細胞中，miR-133b-mimic轉染72小時后miR-133b表達水平明顯上調(p=0.000，p=0.024);而LASP1的mRNA表達水平明顯下調(p=0.017，p=0.006)。
　　2，在ECA10、KYSE510細胞中，si

13、R-LASP1轉染72小時后miR-133b表達水平無明顯變化，而LASP1的mRNA(p=0.006，p=0.039)及蛋白表達水平均明顯下調(p=0.003，p=0.001)。
　　3，MTTassay方法檢測細胞增殖，轉染miR-133b-mimic或siR-LASP1后72小時，ECA109、KYSE510細胞株增殖能力下降最明顯;聯合miR-133b-mimic和siR-LASP1轉染后ECA109、KYSE510細胞株

14、增殖能力較單一轉染miR-133b-mimic或siR-LASP1下降更明顯(p=0.000，p=0.002;p=0.007，p=0.027)。4，Millcell侵襲實驗中，ECA109及KYSE510細胞株轉染miR-133b-mimic或siR-LASP1后18小時，侵襲能力較對照組明顯下降(p=0.001，p=0.000;p=0.001，p=0.000)。
　　5，Millcell遷移實驗中，ECA109及KYSE510細