Notch1胞內(nèi)區(qū)聯(lián)合EGFR抑制劑對(duì)EGFR陽性乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響.pdf

1、第一部分 Notch1胞內(nèi)區(qū)(Notch1-IC)對(duì)EGFR陽性乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響
　　 研究背景：
　　 乳腺癌是嚴(yán)重威脅女性健康的惡性疾患，是導(dǎo)致女性死亡的主要原因之一。闡明乳腺癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制對(duì)于探討新的起協(xié)同作用的和更有效的聯(lián)合治療方案具有重要意義。細(xì)胞的增殖分化過程受多種因素的影響，其異常將導(dǎo)致多種疾病及腫瘤的發(fā)生。探討腫瘤細(xì)胞異常的周期調(diào)控機(jī)制對(duì)于闡明腫瘤的發(fā)生發(fā)展并最終克服腫瘤具有重要意義。

2、r>　　 Notch信號(hào)是在進(jìn)化中高度保守的信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)，廣泛存在于哺乳動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物中，由Notch受體(Notch1-4)、Notch配體(Delta-like1、3-4和Jagged1-2)及細(xì)胞內(nèi)效應(yīng)分子(CSL蛋白：CBF1/Su(H)/LAG-1)組成。Notch受體為一組高度保守的跨膜蛋白質(zhì)，由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)組成。Notch配體通過與相鄰的同型或異型細(xì)胞表面的Notch分子胞外區(qū)結(jié)合而激活Notch分子，釋放具

3、有活性的Notch胞內(nèi)區(qū)(Notch-IC)。Notch-IC進(jìn)而轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，通過CSL等途徑，促進(jìn)Notch目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄。
　　 Notch信號(hào)在乳腺腫瘤中的作用最初是由于在CzechⅡ鼠中發(fā)現(xiàn)MMTV的插入座位而提出。在Notch1、Notch4基因中均發(fā)現(xiàn)了MMTV前病毒的插入，產(chǎn)生異?；罨腘otch信號(hào)，導(dǎo)致鼠乳腺上皮的轉(zhuǎn)化及乳腺腺癌的發(fā)生，提示Notch信號(hào)在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。但是，Notch信號(hào)

4、在人乳腺發(fā)育及腫瘤中的作用研究較少。探討Notch信號(hào)在人類乳腺癌中的表達(dá)活化情況及其在乳腺癌發(fā)展中的具體作用對(duì)于闡明人乳腺癌的發(fā)生發(fā)展具有重要意義，可以為人乳腺癌的治療提供理論依據(jù)。
　　 研究目的：
　　 構(gòu)建攜帶Notch1-IC的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，將其轉(zhuǎn)染EGFR陽性的乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231，篩選出表達(dá)Notchl活化胞內(nèi)區(qū)的單克隆細(xì)胞系MDA-MB-231-ICN，檢測外源性Notch1信號(hào)對(duì)乳腺癌細(xì)胞

5、生物學(xué)行為的影響，探討Notch1信號(hào)在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用。
　　 研究方法：
　　 1.逆轉(zhuǎn)錄病毒的包裝及單克隆細(xì)胞系的篩選
　　 1.1逆轉(zhuǎn)錄病毒的包裝
　　 采用堿裂解法提取質(zhì)粒DNA(包括包膜質(zhì)粒pCMV-VSV-G、包裝質(zhì)粒pKat和目的基因質(zhì)粒pMSCV-ICN/GFP)。采用磷酸鈣-DNA共沉淀法，將包膜質(zhì)粒、包裝質(zhì)粒和目的基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒并收集病毒上清。

6、
　　 1.2單克隆細(xì)胞系的篩選
　　 用逆轉(zhuǎn)錄病毒感染乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231，收集逆轉(zhuǎn)錄病毒感染72h后的MDA-MB-231細(xì)胞，限制性稀釋法篩選出表達(dá)Notch1活化胞內(nèi)區(qū)的陽性單克隆細(xì)胞系MDA-MB-231-ICN。
　　 2.Notchl胞內(nèi)區(qū)(Notch1-IC)對(duì)EGFR陽性乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響
　　 2.1乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染Notch1-IC后，Notch1信號(hào)的表達(dá)檢測

7、r>　　 應(yīng)用Real-time RT-PCR技術(shù)檢測Notch1及其下游效應(yīng)基因mRNA水平表達(dá)情況的改變，應(yīng)用 Western blot檢測相應(yīng)基因蛋白水平表達(dá)情況的改變。
　　 2.2 Notch1信號(hào)對(duì)乳腺癌細(xì)胞的增殖檢測
　　 應(yīng)用MTT方法檢測乳腺癌細(xì)胞系的增殖情況，應(yīng)用PI染色流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期分布，應(yīng)用Real-time RT-PCR技術(shù)檢測細(xì)胞周期相關(guān)蛋白CyclinD、CDK2、P21基因mRN

8、A水平表達(dá)情況的改變，應(yīng)用Western blot檢測相應(yīng)基因蛋白水平表達(dá)情況的改變，應(yīng)用Annexin V/PI染色流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞早期凋亡和晚期凋亡情況。
　　 研究結(jié)果：
　　 1.逆轉(zhuǎn)錄病毒的包裝及單克隆細(xì)胞系的篩選
　　 1.1逆轉(zhuǎn)錄病毒的包裝
　　 HEK293T細(xì)胞為有效的逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞，質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染后可產(chǎn)生高滴度病毒。我們成功轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)48-72h熒光強(qiáng)度最高，于此時(shí)

9、收集病毒上清，備用。
　　 1.2單克隆細(xì)胞系的篩選
　　 逆轉(zhuǎn)錄病毒感染MDA-MB-231細(xì)胞72h后，其熒光強(qiáng)度最高，收集此時(shí)的細(xì)胞，采用限制性稀釋法篩選陽性單克隆細(xì)胞系。成功篩選出穩(wěn)定表達(dá)Notch1活化胞內(nèi)段的單克隆細(xì)胞系MDA-MB-231-ICN。
　　 2.Notch1胞內(nèi)區(qū)(Notch1-IC)對(duì)EGFR陽性乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響
　　 2.1乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染Notch1-IC后，No

10、tch1信號(hào)的表達(dá)增強(qiáng)
　　 Real-time PCR結(jié)果顯示，MDA-MB-231-ICN細(xì)胞Notch1基因在mRNA水平的表達(dá)高于MDA-MB-231細(xì)胞，提示轉(zhuǎn)染后外源性Notch1信號(hào)可以促進(jìn)Notch1基因的轉(zhuǎn)錄。Western blot的結(jié)果與Real-time PCR結(jié)果一致，提示Notch1蛋白的表達(dá)增加。Notch1下游效應(yīng)基因Hes1在mRNA和蛋白水平的表達(dá)均增加，提示Notch1信號(hào)的活化。Notch

11、1下游效應(yīng)基因Hey1的表達(dá)也增加，進(jìn)一步證實(shí)Notch1信號(hào)的活化。
　　 2.2 Notch1信號(hào)促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖
　　 MTT結(jié)果顯示，MDA-MB-231-ICN細(xì)胞的增殖速度高于MDA-MB-231細(xì)胞。細(xì)胞周期分析結(jié)果顯示，MDA-MB-231-ICN細(xì)胞G0期的細(xì)胞顯著低于MDA-MB-231細(xì)胞，提示細(xì)胞周期的進(jìn)展。細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的檢測發(fā)現(xiàn)，與MDA-MB-231細(xì)胞相比，MDA-MB-231-IC

12、N細(xì)胞CyclinD和CDK2在mRNA水平的表達(dá)均增加，而P21的表達(dá)降低，蛋白水平的表達(dá)結(jié)果與mRNA的結(jié)果一致，即CyclinD和CDK2蛋白的表達(dá)增加，而P21蛋白的表達(dá)降低。細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的檢測結(jié)果支持細(xì)胞周期分布的變化。細(xì)胞凋亡分析結(jié)果顯示，MDA-MB-231-ICN細(xì)胞的早期凋亡和晚期凋亡率均低于MDA-MB-231細(xì)胞。
　　 結(jié)論：
　　 我們通過構(gòu)建攜帶Notch1-IC的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，將其轉(zhuǎn)染

13、EGFR陽性的乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231，成功篩選出表達(dá)Notch1活化胞內(nèi)區(qū)的陽性單克隆細(xì)胞系MDA-MB-231-ICN，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染后Notch1信號(hào)的表達(dá)和活化增加。高表達(dá)的Notch1信號(hào)促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞系的增殖，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)展，表明Notch1信號(hào)在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要的促進(jìn)作用。本研究對(duì)闡明人乳腺癌的發(fā)病機(jī)制具有重要作用。
　　 第二部分 EGFR聯(lián)合Notchl信號(hào)在EGFR陽性乳腺

14、癌發(fā)生中的作用
　　 研究背景：
　　 細(xì)胞的增殖分化過程受多種信號(hào)通路的調(diào)控，他們之間不是孤立的發(fā)揮作用，而是在一個(gè)復(fù)雜的細(xì)胞信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中相互作用，共同調(diào)節(jié)細(xì)胞的各項(xiàng)生命活動(dòng)。研究腫瘤細(xì)胞異常的周期調(diào)控機(jī)制對(duì)于闡明腫瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制并最終克服腫瘤具有重要意義。Notch和EGFR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)普遍存在于機(jī)體組織細(xì)胞中，二者相互關(guān)聯(lián)，精確調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)展。Notch和EGFR信號(hào)在腫瘤發(fā)病機(jī)制中的作用已成為研究重點(diǎn)。

15、　　 Notch信號(hào)系統(tǒng)廣泛存在于哺乳動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物中，在進(jìn)化中高度保守。Notch受體活化后，釋放具有活性的Notch胞內(nèi)區(qū)，Notch-IC轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，激活包括Hes在內(nèi)的效應(yīng)器，抑制分化相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，最終達(dá)到抑制細(xì)胞分化、使細(xì)胞保持較原始階段的目的。
　　 EGFR信號(hào)是機(jī)體的另一條重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，廣泛存在于上皮、間質(zhì)及神經(jīng)組織，貫穿于整個(gè)細(xì)胞的生長和增殖過程，對(duì)細(xì)胞的分化選擇起重要的調(diào)節(jié)作用。EGFR家族主要

16、包括EGFR(即 HER1)和HER2-4。EGFR信號(hào)經(jīng)受體酪氨酸磷酸化被激活，通過Ras/Raf/MEK/MAPK途徑級(jí)聯(lián)放大，最后導(dǎo)致MAPK的磷酸化，修飾的MAPK信號(hào)進(jìn)入細(xì)胞核，促進(jìn)目標(biāo)基因的磷酸化，調(diào)節(jié)基因的表達(dá)和活性。EGFR信號(hào)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)，在多種腫瘤如肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌及膀胱癌等中均有表達(dá)。高表達(dá)的EGFR信號(hào)可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，新生血管的形成，腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移等?；颊叱?duì)化療

17、藥物發(fā)生抵抗，預(yù)后較差。以EGFR為靶點(diǎn)的研究結(jié)果已有報(bào)道，EGFR反義RNA體外可以抑制細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。EGFR抑制劑可以引起卵巢癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌及前列腺癌等多種腫瘤細(xì)胞生長受抑，起到抑癌的作用，并且EGFR抑制劑可以增強(qiáng)多種抗腫瘤藥物的細(xì)胞毒作用。
　　 在乳腺癌中，Notch與EGFR信號(hào)的相互作用還不清楚。本研究預(yù)期目標(biāo)的實(shí)現(xiàn)將會(huì)明確EGFR信號(hào)在惡性乳腺癌中的作用，闡明乳腺癌中Notch1和EGFR信

18、號(hào)的相互關(guān)系，進(jìn)一步揭示惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，為腫瘤的基因治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 研究目的：
　　 應(yīng)用EGFR抑制劑gefitinib來抑制EGFR的信號(hào)活性，探討EGFR信號(hào)對(duì)人乳腺癌細(xì)胞系生物學(xué)活性的影響，揭示EGFR與Notch1信號(hào)間的相互作用及機(jī)制。
　　 研究方法：
　　 1.EGFR抑制劑對(duì)乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及機(jī)制
　　 1.1 EGFR抑制劑對(duì)乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影

19、響
　　 選用人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231和MCF-7為研究對(duì)象，在EGFR抑制劑使用前后，應(yīng)用MTT方法檢測乳腺癌細(xì)胞系的增殖情況，應(yīng)用PI染色流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期分布，應(yīng)用Annexin V/PI染色流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞早期凋亡和晚期凋亡情況。
　　 1.2 EGFR抑制劑對(duì)Notch1和EGFR信號(hào)表達(dá)的影響
　　 應(yīng)用Real-time RT-PCR技術(shù)檢測EGFR抑制劑使用前后Notch1和EGF

20、RmRNA水平表達(dá)情況的改變。
　　 2.Notch1與EGFR信號(hào)在乳腺癌發(fā)生中的相互作用
　　 選用MDA-MB-231細(xì)胞和MDA-MB-231-ICN細(xì)胞為研究對(duì)象，比較EGFR抑制劑使用前后乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)活性的改變。應(yīng)用MTT方法檢測乳腺癌細(xì)胞系的增殖情況，應(yīng)用PI染色流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期分布，應(yīng)用Real-time RT-PCR技術(shù)檢測Notch1和EGFR以及細(xì)胞周期相關(guān)蛋白CyclinD、CDK2、P

21、21基因mRNA水平表達(dá)情況的改變，應(yīng)用Annexin V/PI染色流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞早期凋亡和晚期凋亡情況。
　　 研究結(jié)果：
　　 1.EGFR抑制劑對(duì)乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及機(jī)制
　　 1.1 EGFR抑制劑對(duì)乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響
　　 與DMSO溶劑對(duì)照相比，使用EGFR抑制劑后，MTT結(jié)果顯示乳腺癌細(xì)胞的增殖均降低，細(xì)胞周期分析結(jié)果顯示乳腺癌細(xì)胞G0/G1期的細(xì)胞比率均顯著升高，細(xì)胞凋

22、亡分析結(jié)果顯示乳腺癌細(xì)胞的早期和晚期凋亡率均增加。
　　 1.2 EGFR抑制劑對(duì)Notch1和EGFR信號(hào)表達(dá)的影響
　　 Real-time PCR的結(jié)果顯示使用EGFR抑制劑后，MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞中Notch1和EGFR的表達(dá)均降低，表明EGFR信號(hào)的活性降低，提示EGFR與Notch1信號(hào)存在相互作用。
　　 2.Notch1與EGFR信號(hào)在乳腺癌發(fā)生中的相互作用
　　 Real

23、-time PCR的結(jié)果顯示使用EGFR抑制劑后，MDA-MB-231和MDA-MB-231-ICN細(xì)胞中Notch1和EGFR的表達(dá)均降低，但Notch1和EGFR在MDA-MB-231-ICN細(xì)胞中降低的幅度低于相應(yīng)的MDA-MB-231細(xì)胞。
　　 MTT結(jié)果顯示使用EGFR抑制劑后，MDA-MB-231和MDA-MB-231-ICN細(xì)胞的增殖均低于溶劑對(duì)照，但MDA-MB-231-ICN細(xì)胞的增殖速度高于相應(yīng)的MDA-M

24、B-231細(xì)胞。
　　 細(xì)胞周期分析結(jié)果顯示使用EGFR抑制劑后，MDA-MB-231和MDA-MB-231-ICN細(xì)胞G0/G1期的細(xì)胞均顯著高于溶劑對(duì)照，但MDA-MB-231-ICNG0/G1期的細(xì)胞仍低于相應(yīng)的MDA-MB-231 Go/G1期細(xì)胞。細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的檢測發(fā)現(xiàn)使用EGFR抑制劑后，MDA-MB-231和MDA-MB-231-ICN細(xì)胞CyclinD和CDK2在mRNA水平的表達(dá)均降低，而P21的表達(dá)升高。

25、
　　 細(xì)胞凋亡分析結(jié)果顯示，MDA-MB-231和MDA-MB-231-ICN細(xì)胞的早期凋亡和晚期凋亡率均增加，但MDA-MB-231-ICN細(xì)胞的早期凋亡和晚期凋亡率均低于相應(yīng)的MDA-MB-231細(xì)胞。
　　 結(jié)論：
　　 EGFR抑制劑抑制人乳腺癌細(xì)胞系的增殖，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡增加，提示EGFR信號(hào)在人乳腺癌中發(fā)揮正調(diào)控作用?；罨腘otch1信號(hào)可以部分逆轉(zhuǎn)EGFR抑制劑對(duì)乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞毒作