犬冠狀病毒的感染特性及蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、本文分三部分論述了犬冠狀病毒的感染特性及蛋白質(zhì)組學(xué)： 第一部分利用A72細(xì)胞從經(jīng)RT-nPCR檢測(cè)陽性的腹瀉犬糞樣中分離CCV，經(jīng)RT-nPCR和免疫熒光試驗(yàn)鑒定，成功分離到4株CCV野毒，分別命名為CCV KM、NJ2、NJ17、SH3。細(xì)胞適應(yīng)性試驗(yàn)表明，分離到的野毒在A72、ST、PK細(xì)胞上增殖， KM株可導(dǎo)致A72細(xì)胞圓縮、脫落，而NJ2、NJ17、SH3在A72細(xì)胞上不產(chǎn)生明顯的CPE。參考株CCV1-71及野毒KM、

2、NJ2(第8代)都可在A72、MDCK、F81、crFK等細(xì)胞上增殖，只有KM株可在Vero細(xì)胞上增殖，并可見明顯CPE。交叉保護(hù)試驗(yàn)證明，抗KM的血清不能中和其他的CCV毒株，抗CCV1-71的血清可以中和野毒KM、NJ2但是不能中和另外的CCV野毒株HC、DF、HF，說明CCV的毒株的交叉保護(hù)性很有限。對(duì)分離株的部分M基因測(cè)序表明，本研究分離的CCVNJ2、NJ17、sH3與豬傳染性胃腸炎冠狀病毒(TGEV)的同源性達(dá)93.4-97

3、.2％)高于Ⅱ型貓冠狀病毒(FCoV)代表株FIPV 79-1683(75.9-79.7％)。而KM在系統(tǒng)進(jìn)化樹上處于Ⅰ和Ⅱ型CCV之間，可能是一個(gè)新的變異株。 第二部分利用DNA熒光染料Hoechst 33258、細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒及流式細(xì)胞儀技術(shù)對(duì)CCV分離株及參考毒株CCV1-71、TGEV感染的A72細(xì)胞、ST細(xì)胞進(jìn)行了檢測(cè)，以研究CCV感染對(duì)宿主細(xì)胞周期的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在A72細(xì)胞上，分離毒株CCV KM、NJ2、N

4、J17和SH3幾乎對(duì)細(xì)胞的周期沒有影響，呈隱性感染狀態(tài)，而作為對(duì)照的CCV1-71和TGEV可在感染的晚期檢測(cè)到細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。在ST細(xì)胞上，CCV分離株與TGEV在感染的早期未檢測(cè)到細(xì)胞的凋亡和細(xì)胞周期明顯改變，但是在感染晚期，可引起宿主細(xì)胞的凋亡。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CCV可引起感染細(xì)胞在s期聚集。 第三部分建立了穩(wěn)定的CCV1-71感染A72細(xì)胞體系。利用二維電泳技術(shù)對(duì)感染CCV1-71的A72細(xì)胞及同期對(duì)照細(xì)胞的細(xì)胞總

5、蛋白進(jìn)行分離，對(duì)表達(dá)有差異的蛋白質(zhì)進(jìn)行生物質(zhì)譜檢測(cè)(MALDI-TOF-Ms或二級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜)分析。結(jié)果，48蛋白點(diǎn)與CCV感染有關(guān)，其中6個(gè)是病毒N蛋白，33個(gè)蛋白點(diǎn)的表達(dá)上調(diào)，9個(gè)蛋白點(diǎn)表達(dá)下調(diào)。本研究在蛋白質(zhì)的水平上揭示了宿主細(xì)胞對(duì)感染CCV的應(yīng)答。CCV感染后，細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄翻譯活動(dòng)活躍，多種hnRNP表達(dá)上升和翻譯延伸因子表達(dá)有升有降。同時(shí)，細(xì)胞啟動(dòng)對(duì)病毒感染的應(yīng)激活動(dòng)，表現(xiàn)為熱休克蛋白、TCP1、硫氧還蛋白及抗過氧化蛋白等分子伴