馬立克氏病病毒感染雞羽髓蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、馬立克氏病病毒(Marek’s disease virus,MDV)分為馬立克氏病病毒血清1型(Marek'sdisease virus serotype1,MDV1)、血清2型(Marek's disease virug serotyoe2,MDV2)和火雞皰疹病毒(Turkey herpesvirus,HVT)3個血清型,僅MDV1型對雞有致病性。MDV1屬于皰疹病毒科禽皰疹病毒2型,引起以雞免疫功能障礙、惡性淋巴腫瘤和中樞神經(jīng)系統(tǒng)

2、損傷為特征的馬立克氏病(Marek’s diseas,MD),是雞的重要傳染病。馬立克氏病同時也是首個通過疫苗進(jìn)行控制的腫瘤性疾病,因此受到醫(yī)學(xué)界、獸醫(yī)學(xué)界、病毒學(xué)界的廣泛關(guān)注。
　　 MDV具有嚴(yán)格的細(xì)胞結(jié)合性,感染的細(xì)胞至少有4種類型,即B細(xì)胞、T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及羽毛囊和腎的上皮細(xì)胞。但羽髓上皮細(xì)胞(Feather follicl epithelium,FFE)是MDV唯一能夠形成游離的有囊膜的病毒粒子的部位。大量有囊膜的感

3、染性病毒粒子伴隨羽屑的脫落釋放到環(huán)境中成為傳染源。羽髓(Feather pulp)對于MDV的復(fù)制、裝配和MD的傳播流行具有重要意義,因此感染MDV羽髓組織的相關(guān)研究已成為MD的研究熱點之一。但目前此類研究大多從DNA或mRNA水平上進(jìn)行個別基因或蛋白的檢測。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)可以大規(guī)模鑒定蛋白質(zhì),更真實地反映蛋白質(zhì)的表達(dá)情況。本文建立了適宜羽髓組織蛋白樣品的雙向電泳方法,對感染MDV強毒雞羽髓進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析,并對感染不同毒力MDV毒株

4、雞羽髓組織差異蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行研究。
　　 1.建立雞羽髓蛋白雙向電泳方法
　　 以SPF雞羽髓組織為研究對象,以固相pH梯度膠條進(jìn)行等電聚焦為第一向,采用垂直十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酞胺凝膠電泳為第二向進(jìn)行雙向電泳。對上樣量、不同pH范圍膠條、一向設(shè)置參數(shù)、凝膠染色方法等進(jìn)行一系列優(yōu)化。結(jié)果顯示羽髓組織在pH3-10范圍13 cm的2-DE膠上可以得到較好的分離效果,采用R350熱考染染色效果較好。應(yīng)用軟件對凝膠圖譜進(jìn)行初

5、步分析,可分辨的蛋白點約700個,不同樣本間的匹配率大于80％。本研究建立了適宜雞羽髓蛋白的雙向電泳方法,分辨率及可重復(fù)性均較高。該方法的建立為羽髓組織蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供了可靠的技術(shù)基礎(chǔ)。
　　 2.強毒力MDV感染雞羽髓差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究
　　 針對MDV從感染到發(fā)病的四個階段,利用雙向電泳技術(shù)對感染MDV強毒株后4d、7d、14d和21d羽髓組織蛋白的差異表達(dá)情況進(jìn)行分析。結(jié)果顯示在MDV感染后四個時期各有顯著差異表

6、達(dá)蛋白點分別為2個、8個、25個和9個；通過質(zhì)譜技術(shù)鑒定出29種蛋白質(zhì),包括能量代謝相關(guān)蛋白、增殖和凋亡相關(guān)蛋白、細(xì)胞骨架蛋白、信號傳導(dǎo)蛋白、轉(zhuǎn)錄相關(guān)蛋白、免疫相關(guān)蛋白和其他功能蛋白。鑒定的諸多種差異表達(dá)蛋白為進(jìn)一步揭示羽髓中MDV的復(fù)制、基因的表達(dá)以及宿主的應(yīng)答等打下基礎(chǔ)。
　　 3.強、弱毒株感染雞羽髓差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究
　　 針對MDV強、弱毒株的感染可能引起宿主細(xì)胞在蛋白水平上的表達(dá)情況不同。采用雙向電泳技術(shù),將

7、MDV強毒GA株和弱毒疫苗株CVI988感染的羽髓蛋白樣品分別進(jìn)行雙向電泳分離；并分析在MDV復(fù)制的四個階段,強、弱毒株感染后引起宿主蛋白差異表達(dá)情況。結(jié)果顯示感染后7d檢測到4個顯著差異表達(dá)蛋白點,其中相對于疫苗株CVI988感染組,GA株感染后上調(diào)表達(dá)2個,下調(diào)表達(dá)2個。感染后14d檢測到6個顯著差異表達(dá)蛋白點,相對于同時期疫苗株CVI988感染組,這些蛋白點在GA株感染時全部上調(diào)表達(dá)。感染后21d檢測到5個顯著差異表達(dá)蛋白點,其中

8、相對于疫苗株CVI988感染,GA株感染后上調(diào)表達(dá)4個,下調(diào)表達(dá)1個。利用質(zhì)譜技術(shù)鑒定出7個蛋白點代表5種蛋白質(zhì)分別是:LASP-1、heterogeneous nuclear ribonucleoprotein D-like、L-乳酸脫氫酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶和甲硫腺苷磷酸化酶；對于進(jìn)一步揭示MDV致病機(jī)制上的差異及與宿主相互作用關(guān)系上的差異等研究具有重要提示作用。
　　 本研究通過雙向電泳和質(zhì)譜相結(jié)合的技術(shù)對感染MDV雞羽髓蛋白