雌激素缺乏對大鼠顱內(nèi)動脈瘤形成影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景：
　　 顱內(nèi)動脈瘤破裂是神經(jīng)外科最常見的急診疾病之一,是蛛網(wǎng)膜下腔出血的首要因?yàn)?占60％左右。其發(fā)病前無明顯預(yù)兆,發(fā)病急,癥狀重,死亡率及致殘率高。國外文獻(xiàn)報道顱內(nèi)動脈瘤破裂所致的蛛網(wǎng)膜下腔出血的發(fā)病率每年6-21/100,000人。腦血管病是我國居民的第二位死因,1998年衛(wèi)生部統(tǒng)計我國腦血管病死亡人數(shù)城市達(dá)137.72/10萬,農(nóng)村地區(qū)達(dá)113.05/10萬。顱內(nèi)動脈瘤破裂所致死亡率可達(dá)50％,約25％的患者將遭

2、受偏癱、失語、失明等永久性的殘疾,而且生存下來的患者動脈瘤有隨時破裂的可能。另有人統(tǒng)計第一次出血死亡率可高達(dá)40％,第二次出血死亡率可達(dá)60％。綜合文獻(xiàn)報道初次出血24小時內(nèi)出血率最高,達(dá)4.1％,以后每天下降為1.5％,1個月后再出血率銳減,大約為每年3-4％。未破裂動脈瘤每年發(fā)生再次的危險介與1-2％之間。所以對于顱內(nèi)動脈瘤,應(yīng)積極予以治療。目前常用的治療方法有兩種:一種是顯微神經(jīng)外科手術(shù)夾閉動脈瘤瘤頸,使動脈瘤置于血液循環(huán)外,避開

3、血流沖擊,從而避免動脈瘤再次破裂；另一種是血管內(nèi)介入治療技術(shù),通過導(dǎo)管將栓塞材料填塞于動脈瘤瘤腔內(nèi),避開血流沖擊。近年來,神經(jīng)內(nèi)境,神經(jīng)導(dǎo)航系統(tǒng)等應(yīng)用提高了顯微外科手術(shù)的療效；隨著影像學(xué)的不斷發(fā)展,介入新材料的出現(xiàn),血管內(nèi)治療動脈瘤的療效也越來越好,有部分學(xué)者提出將栓塞治療作為顱內(nèi)動脈瘤的首選治療方法。
　　 隨著醫(yī)療技術(shù)的不斷發(fā)展,對顱內(nèi)動脈瘤的臨床治療已經(jīng)取得了很大的發(fā)展,但對其形成、生長、破裂的機(jī)制還不很清楚。動脈瘤的發(fā)病

4、是多因素的,通常按其不同病因分為5類:①先天性動脈瘤;②感染性動脈瘤;③外傷性動脈瘤;④動脈硬化性動脈瘤;⑤剝離性動脈瘤。其中絕大部分是“先天性動脈瘤”,即通常稱之為囊性動脈瘤(sacctnar aneurysm)或漿果樣動脈瘤(berryaneurysm)。動脈瘤的病因大概可以分為三類:遺傳或先天性因素致病的先天學(xué)說、顱內(nèi)動脈獲得性退行性病變導(dǎo)致血管破壞的后天學(xué)說和綜合學(xué)說。近年來人們試圖通過對動脈瘤動物模型的研究,揭示顱內(nèi)動脈瘤的病

5、因發(fā)病機(jī)理,為臨床研究提供條件。而如何設(shè)計和制作與人體動脈瘤生理特性相一致的動脈瘤動物模型是開展此類研究的基礎(chǔ)、難點(diǎn)和關(guān)鍵。目前制作動脈瘤模型的主要方法主要有:外科手術(shù)移植法、動脈局部破壞法、酶破環(huán)血管壁法、血管內(nèi)介入法,病因誘導(dǎo)法等。
　　 現(xiàn)在比較公認(rèn)的動脈瘤常見發(fā)病危險因素有吸煙、酗酒、高血壓,這些危險因素在男性中比在女性中更普遍,但流行病學(xué)資料顯示,女性特別是絕經(jīng)后發(fā)病率明顯高于男性(ratio:60/40),大多女性患

6、者集中在50-59歲年齡段。流行病學(xué)資料調(diào)查顯示,顱內(nèi)動脈瘤患者39歲以下女性占44％,40-49歲女性占55％,50-59歲女性占到77％。W.T.Longstreth等研究也發(fā)現(xiàn)[8],女性絕經(jīng)前的蛛網(wǎng)膜下腔出血發(fā)病率要比絕經(jīng)后低(odds ratio,0.24:CI,0.09-0.68),長期或經(jīng)常服用雌激素替代治療的絕經(jīng)后女性比不服用雌激素絕經(jīng)后女性發(fā)病率會降低(p<0.002)。
　　 第一部分:低雌激素水平模型、動脈

7、瘤模型的制作及標(biāo)本的獲取和初步研究
　　 目的：
　　 建立雌激素缺乏的動脈瘤模型,并且在此基礎(chǔ)上初步研究雌激素缺乏對顱內(nèi)動脈瘤形成及生長的影響及可能機(jī)制。
　　 方法
　　 雌性Wistar大鼠30只,隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組、實(shí)驗(yàn)對照組、空白對照組,各10只。實(shí)驗(yàn)組:切除雙側(cè)卵巢+動脈瘤模型；實(shí)驗(yàn)對照組:切除雙側(cè)卵巢旁與其大小相當(dāng)?shù)囊粔K脂肪+動脈瘤模型；空白對照組:不做任何處理。大鼠去勢模型或腹部假手術(shù)模型制作

8、后2周后,用豬胰彈性蛋白酶(E1250 Sigma)滴加到頸外動脈及分叉處動脈壁周圍,在頸外動脈距分叉處約1.5mm位點(diǎn),用兩根手術(shù)線結(jié)扎頸外動脈,在兩根線之間剪斷頸外動脈,使頸外動脈的盲段形成頸內(nèi)動脈的一個動脈瘤。動脈瘤模型制作6周后,快速打開大鼠胸腔暴露心臟,右心房取 全血2ml,離心、取上清液后于-20℃冰箱保存,用于檢測大鼠血清中雌激素的含量；同時取實(shí)驗(yàn)組及實(shí)驗(yàn)對照組的動脈瘤組織和空白對照組相應(yīng)的一段頸外動脈組織,用于常規(guī)組織切

9、片染色。
　　 結(jié)果
　　 血漿中雌激素水平實(shí)驗(yàn)組為(105.00±12.96)pmol/L,實(shí)驗(yàn)對照組為(178.50±25.96)pmol/L,空白對照組(180.40±18.70)pmol/L；實(shí)驗(yàn)組與實(shí)驗(yàn)對照組及空白對照組分別比較(p<0.01),與兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)組動脈瘤長度擴(kuò)張率(131.31±6.63)％,實(shí)驗(yàn)對照組動脈瘤長度擴(kuò)張率(109.90±3.44)％,Z=9.061,p<0.01,。實(shí)驗(yàn)

10、組動脈瘤直徑擴(kuò)張率(125.10±5.49)％,實(shí)驗(yàn)對照組動脈瘤直徑擴(kuò)張率(106.82±2.49)％,t=9.597,p<0.01.
　　 結(jié)論
　　 雌激素缺乏對顱內(nèi)動脈瘤的形成、生長有一定的促進(jìn)作用,本研究使用盲段法結(jié)合酶消化法制作動脈瘤模型簡便可行。
　　 第二部分 雌激素缺乏對大鼠顱內(nèi)動脈瘤組織MMP-9表達(dá)影響的研究
　　 目的：
　　 應(yīng)用第一部分所取得的動脈瘤組織標(biāo)本,初步研究雌激

11、素缺乏對動脈瘤組織MMP-9表達(dá)的影響。
　　 方法
　　 1.免疫熒光:從-20℃箱取出組織切片,室溫下晾干,清洗；然后加4％多聚甲醛固定,0.01M PBS液清洗,加入配好的5％山羊血清封閉,然后分別加一抗兔抗Anti-MMP-9(1:400),放置于4℃濕盒過夜；0.01M PBS液再清洗三次；加入羊抗兔IgG(綠色,1:400)熒光標(biāo)記二抗、室溫避光1小時；再0.01MPBS液清洗3次；滴加封片劑一滴,封片,熒光

12、顯微鏡檢查,或放入4℃冰箱保存待盡早觀察。
　　 2.western Blot:首先測定樣本蛋白的濃度然后進(jìn)行,清洗玻璃板,灌膠與上樣,電泳,加一抗、二抗進(jìn)行免疫反應(yīng)化學(xué)發(fā)光,最后顯影,定影.
　　 結(jié)果
　　 免疫熒光:在動脈瘤血管壁可見MMP-9陽性細(xì)胞主要位于動脈壁中、外膜,實(shí)驗(yàn)組較對空白對照組、實(shí)驗(yàn)對照組均明顯。western blot:在動脈瘤血管壁中都有MMP-9蛋白的存在,實(shí)驗(yàn)組較實(shí)驗(yàn)對照組量多,空