血管內(nèi)皮祖細胞對大鼠骨髓間充質干細胞生物學特性調(diào)控作用的研究.pdf

1、慢性骨疾病如骨質疏松、成骨不全等,是最為常見的骨代謝異常疾病,也是導致骨折和骨缺損的主要原因之一,并嚴重影響到牙齒、牙周組織以及頜骨的健康。骨代謝異常時,可能會打破自體干細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài),從而抑制干細胞的生物學特性和功能,影響骨組織的再生與修復。骨髓間充質干細胞(BMSCs)因其具有自我更新及多向分化潛能,已成為骨再生的重要種子細胞,對骨缺損有較好的修復能力。然而,在慢性骨疾病環(huán)境下,BMSCs會因不良的微環(huán)境和局部營養(yǎng)供給的影響而使其

2、生物學活性和功能受到抑制,影響骨修復能力。近年來發(fā)現(xiàn)的血管內(nèi)皮祖細胞(EPCs)被證實具有新生血管、促進局部營養(yǎng)支持和改善微環(huán)境的功能。因此,我們希望可以利用EPCs來促進BMSCs的生物學活性和功能,以提高BMSCs的骨再生能力。本實驗通過建立Transwell間接共培養(yǎng)體系,來探索EPCs是否具有提高大鼠BMSCs(rBMSCs)生物學特性的功能,為進一步促進BMSCs的骨修復能力奠定理論基礎,對開發(fā)治療骨質疏松等新的治療策略具有重

3、要意義。
　　研究目的：
　　1.探討間接共培養(yǎng)條件下,EPCs對rBMSCs細胞轉歸的影響。
　　2.探討間接共培養(yǎng)條件下,EPCs對rBMSCs干性的調(diào)控作用。
　　3.探討間接共培養(yǎng)條件下,EPCs對rBMSCs增殖、凋亡、分化的調(diào)控作用。
　　4.探討EPCs對rBMSCs體內(nèi)骨修復能力的影響。
　　研究方法：
　　1.利用密度梯度離心法結合全骨髓貼壁法分離培養(yǎng) rBMSCs,倒置顯微鏡

4、觀察細胞形態(tài);流式細胞技術檢測細胞表面分子的表達;克隆集落形成、MTT法檢測細胞增殖能力。成骨、成脂誘導檢測細胞多向分化能力。
　　2.采用密度梯度離心法分離出骨髓中單個核細胞,利用條件培養(yǎng)基結合差速貼壁法進行培養(yǎng)和純化 EPCs,通過對原代細胞形態(tài)學特征的連續(xù)性觀察、細胞分子表型基因的表達檢測、體外小管形成實驗以及免疫組化和免疫雙熒光染色等方法對EPCs進行綜合鑒定。
　　3.建立 EPCs、BMSCs transwell

5、間接共培養(yǎng)體系, RT-PCR、流式細胞儀以及DiI-acLDL熒光染色檢測BMSCs細胞的轉歸。
　　4.間接共培養(yǎng)后,RT-PCR檢測干性轉錄因子在 rBMSCs中的表達情況,real-time PCR檢測其基因表達量的變化;EDU熒光標記法、CFU-F形成率及流式細胞儀檢測BMSCs增殖及凋亡情況;ALP染色、酶活性定量檢測以及茜素紅染色觀察BMSCs堿性磷酸酶和鈣化結節(jié)的形成情況,real-time PCR和Western

6、 blot檢測成骨標志性基因的表達量變化;油紅O染色觀察EPCs對BMSCs成脂分化的影響, real-time PCR和Western blot檢測成脂相關基因及蛋白的表達量變化。
　　5.建立大鼠牙槽骨缺損模型,將經(jīng)EPCs作用過的rBMSCs復合生物支架材料移植入骨缺損區(qū),通過 CM-Dil熒光標記進行細胞體內(nèi)示蹤,對術后的標本組織進行大體觀察,MicroCT掃描、新骨骨密度檢測以及組織HE染色來檢測BMSCs的骨再生能力。

7、
　　實驗結果：
　　1.體外分離培養(yǎng)的rBMSCs多呈長梭形、多角形,可以形成單細胞克隆集落,細胞增殖呈典型的―S‖形,表達間充質細胞表面標志物,而不表達造血系細胞的標志物,并具有成骨、成脂分化的能力,證明所培養(yǎng)的細胞是BMSCs。
　　2.經(jīng)過條件培養(yǎng)基結合差速貼壁法培養(yǎng)的單個核細胞在原代早期呈長梭形,而晚期則轉變?yōu)殇伮肥癄?。細胞同時具有造血干細胞和內(nèi)皮細胞表面標志物的雙重表達,體外可以形成類似微血管樣的結構,并且

8、對單核細胞及內(nèi)皮細胞特異分子免疫組化及雙熒光染色呈陽性表達,證實所分離培養(yǎng)的單個核細胞為EPCs。
　　3.與EPCs間接培養(yǎng)后的BMSCs,其細胞形態(tài)及細胞表面分子的表達與對照組相比,沒有明顯差別。因此,在間接共培養(yǎng)條件下,EPCs并未明顯改變BMSCs的細胞表型。
　　4.間接共培養(yǎng)后,EPCs可以有效維護 rBMSCs干性轉錄因子的基因表達量,并增強BMSCs細胞DNA合成能力和細胞增殖能力,但對BMSCs的凋亡沒有明

9、顯調(diào)控作用。另外,EPCs的間接刺激可以有效促進 rBMSCs體外成骨及成脂分化能力。
　　5. EPCs于體外間接作用后,可以增強BMSCs在體內(nèi)的骨修復能力。
　　結論：
　　1.間接共培養(yǎng)條件下,EPCs不會改變BMSCs細胞表型特征。
　　2.間接共培養(yǎng)條件下,EPCs能夠維持BMSCs的細胞干性,并促進其體外增殖及分化能力,但對BMSCs的細胞凋亡沒有影響。
　　3.經(jīng)EPCs間接刺激后的BMSC