骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)炎癥時(shí)血管內(nèi)皮細(xì)胞TM表達(dá)的影響.pdf

1、目的：
　　1.體外研究觀察炎癥反應(yīng)中小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞TM表達(dá)的影響。
　　2.探討骨髓間質(zhì)干細(xì)胞對(duì)炎癥早期凝血紊亂的影響。
　　方法：
　　1.體外原代培養(yǎng)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，細(xì)胞貼壁差速法原代提取培養(yǎng)小鼠主動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞，肺泡內(nèi)灌洗液原代培養(yǎng)小鼠肺泡內(nèi)巨噬細(xì)胞，10％FBS培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況。
　　2.將原代培養(yǎng)的第四代血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞爬片后，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行Ⅷ

2、因子相關(guān)抗原即血管性血友病因子(von Willebrand factor, vWF)免疫熒光化學(xué)反應(yīng)，觀察并根據(jù)熒光顯微鏡下血管內(nèi)皮細(xì)胞的vWF表達(dá)狀況進(jìn)行細(xì)胞鑒定，陽(yáng)性信號(hào)為綠色熒光。
　　3.將第五代小鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞分為對(duì)照組和誘導(dǎo)組，對(duì)照組細(xì)胞按10％FBS完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，誘導(dǎo)組細(xì)胞用配制好的細(xì)胞成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)液培養(yǎng)，兩組細(xì)胞在相同條件下培養(yǎng)2周后，用油紅染色，顯微鏡下觀察細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)是否有脂滴形成。
　　4.以肺泡巨

3、噬細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞體外共培養(yǎng)為基礎(chǔ)，LPS不同濃度0ug/ml，0.01ug/ml，0.1ug/ml，1ug/ml，10ug/ml刺激培養(yǎng)的細(xì)胞，不同作用時(shí)間0h，3h，6h，12h刺激培養(yǎng)的細(xì)胞，觀察TM動(dòng)態(tài)變化，以選擇LPS的最佳作用濃度和時(shí)間。
　　5.以肺泡巨噬細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞體外共培養(yǎng)為基礎(chǔ)，以PBS刺激為對(duì)照，將細(xì)胞分為四組，即BMSCs對(duì)照組、空白對(duì)照組、BMSCs治療組及脂多糖(lipopolysacchari

4、de，LPS)對(duì)照組。BMSCs對(duì)照組和BMSCs治療組為三種細(xì)胞體外共培養(yǎng)，BMSCs治療組及脂多糖對(duì)照組兩組加入LPS刺激，LPS終濃度為1ug/ml。LPS刺激6h后，提取RNA和蛋白質(zhì)，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)和Western blotting技術(shù)檢測(cè)各組6h TM的基因和蛋白表達(dá)變化，以及蛋白定量檢測(cè)與細(xì)胞凋亡有關(guān)的蛋白BAX和BCL-2變化，BAX/BCL-2的比值變化。
　　結(jié)果：
　　1.熒光顯微鏡下觀察血

5、管內(nèi)皮細(xì)胞vWF表達(dá)并拍照，可見(jiàn)各細(xì)胞表面有幾乎布滿綠色熒光，vWF的陽(yáng)性信號(hào)為綠色熒光，可鑒定從主動(dòng)脈血管提取的原代培養(yǎng)細(xì)胞為血管內(nèi)皮細(xì)胞。
　　2.顯微鏡下可見(jiàn)對(duì)照組小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)沒(méi)有明顯變化，誘導(dǎo)組小鼠BMSCs胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大小不等的脂滴并被油紅染色成橙紅色，說(shuō)明小鼠BMSCs細(xì)胞具有可被誘導(dǎo)向脂肪細(xì)胞分化的能力。
　　3.用LPS五個(gè)不同濃度分別刺激細(xì)胞6h后，LPS用量濃度為1ug/ml時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞TM明顯低

6、于其他濃度(P＜0.001)，以1ug/ml LPS濃度作用細(xì)胞0h，3h，6h，12h四個(gè)時(shí)間點(diǎn)，LPS作用6h時(shí)，TM明顯減少，低于其他三組。LPS在濃度為1ug/ml，作用時(shí)間6h時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞TM減少最明顯(P＜0.05)，作為L(zhǎng)PS的最佳作用濃度和時(shí)間。
　　4.四組血管內(nèi)皮細(xì)胞TM mRNA的表達(dá)量有所差異，其中BMSCs對(duì)照組與空白對(duì)照組TM mRNA表達(dá)無(wú)顯著差異(P＞0.05);與BMSCs對(duì)照組、空白對(duì)照組比較，

7、LPS對(duì)照組血管內(nèi)皮細(xì)胞TM的mRNA表達(dá)量相對(duì)明顯減少(P＜0.05);與LPS對(duì)照組相比，BMSCs治療組血管內(nèi)細(xì)胞TM的mRNA表達(dá)量相對(duì)明顯增加(P＜0.01)。
　　5.四組血管內(nèi)皮細(xì)胞TM蛋白的表達(dá)量也有所差異，與LPS對(duì)照組相比，BMSCs治療組血管內(nèi)細(xì)胞TM的蛋白表達(dá)量明顯增加(P＜0.01);與BMSCs對(duì)照組、空白對(duì)照組比較，LPS對(duì)照組血管內(nèi)皮細(xì)胞TM的蛋白表達(dá)量相對(duì)明顯減少(P＜0.05);而B(niǎo)MSCs對(duì)照

8、組與空白對(duì)照組TM蛋白表達(dá)量無(wú)明顯差異(P＞0.05)。
　　6.LPS對(duì)照組細(xì)胞凋亡基因Bax蛋白表達(dá)量明顯高于其他三組(P＜0.05)，并且BMSCs治療組細(xì)胞抑制基因Bcl-2蛋白表達(dá)量明顯高于其他三組(P＜0.05)，BMSCs治療組BAX/BCL-2比值低于LPS對(duì)照組(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.LPS刺激后血管內(nèi)皮細(xì)胞TM mRNA和蛋白表達(dá)減少，細(xì)胞凋亡基因BAX蛋白表達(dá)增加。
　　2.