三江白豬leptin的制備及其對(duì)小鼠繁殖性能和脂肪代謝的影響.pdf

1、Leptin是ob基因的表達(dá)產(chǎn)物，是由脂肪細(xì)胞分泌的一種16kDa的蛋白，與動(dòng)物的采食量、能量代謝、繁殖與生產(chǎn)性能的調(diào)控有密切關(guān)系，目前國(guó)外已初步應(yīng)用于人和嚙齒類(lèi)動(dòng)物攝食與能量平衡的調(diào)控。但是對(duì)豬的研究才剛剛起步，因此，在體外進(jìn)行其克隆表達(dá)為進(jìn)一步研究leptin在改善動(dòng)物繁殖性能、肉品品質(zhì)和治療人類(lèi)肥胖癥方面的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。本研究利用基因工程原理及現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)研究了如下內(nèi)容： 1．三江白豬ob基因的克隆與序列分析從

2、健康三江白豬的皮下脂肪組織中提取總RNA，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的豬ob基因序列設(shè)計(jì)引物，采用RT-PCR方法擴(kuò)增出ob基因。并將所獲得的目的基因插入pMD18-T克隆載體，構(gòu)建克隆質(zhì)粒pMD18-T-ob，然后經(jīng)雙酶切、PCR鑒定，將鑒定正確的質(zhì)粒進(jìn)行序列測(cè)定，基因序列分析表明與GenBank中豬ob基因的編碼序列一致為441bp，說(shuō)明所克隆的基因正確。 2．三江白豬ob基因在大腸桿菌中的表達(dá)及其多克隆抗體的制備在獲得三江白豬ob基因重

3、組質(zhì)粒pMD18-T-ob的基礎(chǔ)上，成功地構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-ob；然后將表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中，使用IPTG誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)。SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果顯示，三江白豬ob基因在大腸桿菌中得到了正確表達(dá)。將初步純化的表達(dá)產(chǎn)物作為抗原免疫小白鼠，制每三江白豬ob基因的多克隆抗體。同時(shí)對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行復(fù)性。應(yīng)用ELISA檢測(cè)到較高的多克隆抗體效價(jià)(1：25600)，表明此蛋白具有良好的免疫原性。Western-

4、blot結(jié)果顯示；利用純化包涵體制備的鼠抗血清可以很好地和所表達(dá)的蛋白帶特異性結(jié)合。 3．原核表達(dá)leptin復(fù)性后對(duì)小白鼠繁殖性能及脂肪調(diào)控的研究利用小白鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)復(fù)性后leptin的生物學(xué)活性。結(jié)果表明，復(fù)性后的leptin可使小白鼠的采食量、體重顯著降低；使小白鼠的初情期提前約6.1天；血清游離脂肪酸、甘油三酯含量也顯著下降。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，我們所表達(dá)的leptin經(jīng)復(fù)性后具有較好的生物學(xué)活性。 本實(shí)驗(yàn)獲得了