PB轉(zhuǎn)座子和To12轉(zhuǎn)座子介導基因長期表達的研究.pdf

1、第—部分量化檢測SEAP報告基因方法的探索
　　目前對SEAP報告基因的檢測普遍是通過檢測SEAP反應吸光值的方法來進行的，然而，由于吸光值檢測會受到實驗條件等因素的影響，所以，不同實驗室對SEAP檢測的結(jié)果很難進行比較分析，限制了SEAP報告基因的應用。因此，十分需要建立一種對SEAP基因的表達量進行定量檢測的方法。
　　我們建立了一種可以在不同實驗條件下，通過檢測SEAP反應的吸光值計算出SEAP蛋白質(zhì)量的方法，對SEA

2、P檢測的實驗結(jié)果可以進行準確的比較分析，為SEAP報告基因更好的應用于科學研究中提供了支持。
　　方法:
　　通過建立SEAP反應產(chǎn)物對硝基苯酚的標準曲線，根據(jù)Lambert-Beer定律:A=ε×c×d，計算出我們實驗條件下的對硝基苯酚的摩爾消光系數(shù)，結(jié)合SEAP酶的比活，進而推導出SEAP反應吸光值與SEAP質(zhì)量之間的關系式，可以應用于檢測細胞上清和小鼠血清中SEAP的表達量。
　　結(jié)果:
　　建立了一種可以

3、應用于在不同實驗條件下，通過檢測SEAP反應的吸光值計算出SEAP蛋白質(zhì)量的方法。推導出在我們的實驗條件下，待測樣品中SEAP濃度（μg·L-1）的計算公式為:c=△A/min×33.35×稀釋倍數(shù)，所以，SEAP蛋白質(zhì)量（μg）的計算公式為:m=△A/min×33.35×稀釋倍數(shù)×樣品體積。我們將得到的公式成功的應用于細胞上清和小鼠血清中SEAP量的檢測。在小鼠尾靜脈快沖實驗中，檢測到小鼠體內(nèi)SEAP的表達量隨著時間的推移逐漸降低。<

4、br>　　結(jié)論:
　　我們建立了一種可以將SEAP檢測從對吸光值的比較上升到可進行量化比較的方法，并且該方法能夠應用于不同實驗的條件，為SEAP報告基因更好的應用提供了支持。
　　第二部分 PB轉(zhuǎn)座子和Tol2轉(zhuǎn)座子介導基因長期表達作用的初步探索
　　轉(zhuǎn)座子(Transposon)是一類相對獨立的DNA片段，能夠在宿主基因組中通過“剪切和粘貼”的機制發(fā)生位置的移動，其移動位置的過程稱為轉(zhuǎn)座(Transposition)

5、。由于具有轉(zhuǎn)座的功能，轉(zhuǎn)座子作為一種分子遺傳學工具被廣泛的應用于轉(zhuǎn)基因和插入突變等研究中，轉(zhuǎn)座子現(xiàn)在已成為生命科學研究中的一個熱點。
　　使用病毒載體可以使基因有效地整合到基因組中，但是病毒載體存在可攜帶的DNA片段較小和制作成本較高等問題，限制了病毒載體的使用。轉(zhuǎn)座子同樣具有促進基因整合到基因組中并實現(xiàn)整合基因長期表達的功能，同時，使用轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)僅需將質(zhì)粒導入細胞中即可發(fā)揮轉(zhuǎn)座作用，而且轉(zhuǎn)座子還具有DNA運載容量大和制作成本低等

6、優(yōu)點。我們選擇了應用比較廣泛的Tol2轉(zhuǎn)座子和piggyBac(PB)轉(zhuǎn)座子作為實驗材料，在CHO細胞和HEK293T細胞中對轉(zhuǎn)座子介導基因長期表達的情況進行了探索，為轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)應用于基因長期表達的研究提供了支持。
　　方法:
　　我們首先在CHO細胞中用帶有熒光蛋白表達框架的PB轉(zhuǎn)座子和Tol2轉(zhuǎn)座子進行了轉(zhuǎn)染實驗，在轉(zhuǎn)染后不同的時間點，通過用熒光顯微鏡觀察熒光蛋白表達量的變化情況，探索了轉(zhuǎn)座子介導熒光蛋白基因長期表達的情

7、況。接著，我們采用了可以進行定量比較的SEAP報告基因在HEK293T細胞和CHO細胞中進行了轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)染實驗，在轉(zhuǎn)染后不同的時間點，通過采集細胞培養(yǎng)上清進行SEAP表達量的實時檢測，探索了轉(zhuǎn)座子介導SEAP基因長期表達的情況。
　　結(jié)果:
　　用PB轉(zhuǎn)座子和Tol2轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)染CHO細胞后，用熒光顯微鏡觀察到轉(zhuǎn)座子能夠介導熒光蛋白持續(xù)表達超過一個月。PB轉(zhuǎn)座子和Tol2轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)染HEK293T細胞和CHO細胞后，跟蹤檢測SE