PB轉座子和To12轉座子介導基因長期表達的研究.pdf

1、第—部分量化檢測SEAP報告基因方法的探索
　　目前對SEAP報告基因的檢測普遍是通過檢測SEAP反應吸光值的方法來進行的，然而，由于吸光值檢測會受到實驗條件等因素的影響，所以，不同實驗室對SEAP檢測的結果很難進行比較分析，限制了SEAP報告基因的應用。因此，十分需要建立一種對SEAP基因的表達量進行定量檢測的方法。
　　我們建立了一種可以在不同實驗條件下，通過檢測SEAP反應的吸光值計算出SEAP蛋白質量的方法，對SEA

2、P檢測的實驗結果可以進行準確的比較分析，為SEAP報告基因更好的應用于科學研究中提供了支持。
　　方法:
　　通過建立SEAP反應產物對硝基苯酚的標準曲線，根據(jù)Lambert-Beer定律:A=ε×c×d，計算出我們實驗條件下的對硝基苯酚的摩爾消光系數(shù)，結合SEAP酶的比活，進而推導出SEAP反應吸光值與SEAP質量之間的關系式，可以應用于檢測細胞上清和小鼠血清中SEAP的表達量。
　　結果:
　　建立了一種可以

3、應用于在不同實驗條件下，通過檢測SEAP反應的吸光值計算出SEAP蛋白質量的方法。推導出在我們的實驗條件下，待測樣品中SEAP濃度（μg·L-1）的計算公式為:c=△A/min×33.35×稀釋倍數(shù)，所以，SEAP蛋白質量（μg）的計算公式為:m=△A/min×33.35×稀釋倍數(shù)×樣品體積。我們將得到的公式成功的應用于細胞上清和小鼠血清中SEAP量的檢測。在小鼠尾靜脈快沖實驗中，檢測到小鼠體內SEAP的表達量隨著時間的推移逐漸降低。<

4、br>　　結論:
　　我們建立了一種可以將SEAP檢測從對吸光值的比較上升到可進行量化比較的方法，并且該方法能夠應用于不同實驗的條件，為SEAP報告基因更好的應用提供了支持。
　　第二部分 PB轉座子和Tol2轉座子介導基因長期表達作用的初步探索
　　轉座子(Transposon)是一類相對獨立的DNA片段，能夠在宿主基因組中通過“剪切和粘貼”的機制發(fā)生位置的移動，其移動位置的過程稱為轉座(Transposition)

5、。由于具有轉座的功能，轉座子作為一種分子遺傳學工具被廣泛的應用于轉基因和插入突變等研究中，轉座子現(xiàn)在已成為生命科學研究中的一個熱點。
　　使用病毒載體可以使基因有效地整合到基因組中，但是病毒載體存在可攜帶的DNA片段較小和制作成本較高等問題，限制了病毒載體的使用。轉座子同樣具有促進基因整合到基因組中并實現(xiàn)整合基因長期表達的功能，同時，使用轉座子系統(tǒng)僅需將質粒導入細胞中即可發(fā)揮轉座作用，而且轉座子還具有DNA運載容量大和制作成本低等

6、優(yōu)點。我們選擇了應用比較廣泛的Tol2轉座子和piggyBac(PB)轉座子作為實驗材料，在CHO細胞和HEK293T細胞中對轉座子介導基因長期表達的情況進行了探索，為轉座子系統(tǒng)應用于基因長期表達的研究提供了支持。
　　方法:
　　我們首先在CHO細胞中用帶有熒光蛋白表達框架的PB轉座子和Tol2轉座子進行了轉染實驗，在轉染后不同的時間點，通過用熒光顯微鏡觀察熒光蛋白表達量的變化情況，探索了轉座子介導熒光蛋白基因長期表達的情

7、況。接著，我們采用了可以進行定量比較的SEAP報告基因在HEK293T細胞和CHO細胞中進行了轉座子的轉染實驗，在轉染后不同的時間點，通過采集細胞培養(yǎng)上清進行SEAP表達量的實時檢測，探索了轉座子介導SEAP基因長期表達的情況。
　　結果:
　　用PB轉座子和Tol2轉座子轉染CHO細胞后，用熒光顯微鏡觀察到轉座子能夠介導熒光蛋白持續(xù)表達超過一個月。PB轉座子和Tol2轉座子轉染HEK293T細胞和CHO細胞后，跟蹤檢測SE