PiggyBac轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)外源基因在豬成纖維細(xì)胞及胚胎中表達(dá)研究.pdf

1、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是指以實(shí)驗(yàn)方法導(dǎo)入外源基因,在染色體組內(nèi)穩(wěn)定整合并能遺傳給后代的一類(lèi)動(dòng)物。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物有非常重大的生產(chǎn)和科研作用。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是對(duì)多種生命現(xiàn)象本質(zhì)深入了解的工具,如研究基因的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,細(xì)胞發(fā)育的潛能性,細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)的相互關(guān)系,胚胎發(fā)育調(diào)控,腫瘤,神經(jīng)與發(fā)育等;并可以用來(lái)建立多種疾病的動(dòng)物模型,進(jìn)而研究這些疾病的發(fā)病機(jī)理及治療方法;還能提高動(dòng)物育種效率。另外轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可作為醫(yī)用或食用蛋白的生物反應(yīng)器。但是目前轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的生

2、產(chǎn)也遇到了一些問(wèn)題,比如利用質(zhì)粒的隨機(jī)整合得到的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在傳代過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)外源基因的丟失,位置效應(yīng)和甲基化的影響會(huì)造成外源基因表達(dá)效率的下降;病毒感染體系中病毒滴度和隨之產(chǎn)生的輔助病毒限制了其在臨床和生產(chǎn)上的應(yīng)用,因此,尋找到一個(gè)合適的轉(zhuǎn)基因載體是轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)的重要環(huán)節(jié)。本研究利用來(lái)自鱗翅目昆蟲(chóng)的piggyBac轉(zhuǎn)座子作為轉(zhuǎn)基因載體,將外源基因(EGFP和Follistatin)導(dǎo)入到豬的胎兒成纖維細(xì)胞,并將攜帶轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞作

3、為核移植供體細(xì)胞進(jìn)行核移植,得到轉(zhuǎn)基因的豬核移植胚胎,系統(tǒng)的評(píng)價(jià)了piggyBac轉(zhuǎn)座子作為轉(zhuǎn)基因載體在豬的轉(zhuǎn)基因生產(chǎn)中的優(yōu)缺點(diǎn),為piggyBac轉(zhuǎn)座子應(yīng)用于豬的轉(zhuǎn)基因生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。本研究得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
　　 1細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染piggyBac轉(zhuǎn)座子體系和pEGFP-C1隨機(jī)整合體系,兩個(gè)轉(zhuǎn)染體系在12小時(shí)和48小時(shí)的時(shí)候,EGFP的表達(dá)沒(méi)有差異,但是在轉(zhuǎn)染24小時(shí)的時(shí)候,隨機(jī)整合體系的EGFP表達(dá)比piggyBac轉(zhuǎn)座子體

4、系EGFP表達(dá)高,而且差異顯著。
　　 2細(xì)胞篩選10天后,進(jìn)行形成的細(xì)胞集落計(jì)數(shù),并將計(jì)數(shù)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,來(lái)表示兩種不同轉(zhuǎn)染體系的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)piggyBac轉(zhuǎn)座子體系得到的細(xì)胞集落數(shù)是pEGFP-C1體系得到的細(xì)胞集落數(shù)的18倍,差異顯著。
　　 3利用基因組步移技術(shù)檢測(cè)了piggyBac轉(zhuǎn)座子5'端旁側(cè)序列。測(cè)序結(jié)果顯示,所有的轉(zhuǎn)座子片段都是以轉(zhuǎn)座的方式整合到基因組上的,插入的都是TTAA四核苷酸位點(diǎn),

5、沒(méi)有發(fā)現(xiàn)隨機(jī)整合的現(xiàn)象。
　　 4將基因組步移得到的片段和豬的基因組進(jìn)行比對(duì),以驗(yàn)證piggyBac轉(zhuǎn)座子的插入位點(diǎn)信息。由于目前豬的基因組全序列還不完整,還無(wú)法完全得知這些片段的插入位點(diǎn)。但是仍然在豬的2,9,15號(hào)染色體上發(fā)現(xiàn)了同源序列。
　　 5為了檢測(cè)piggyBac轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的外源基因在豬基因組上的拷貝數(shù),利用southernblot檢測(cè)外源基因的拷貝數(shù)。結(jié)果表明轉(zhuǎn)座子可以介導(dǎo)外源基因在豬基因組上的多拷貝整合。

6、
　　 6為了檢測(cè)轉(zhuǎn)座和隨機(jī)整合兩種方式得到的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中外源基因的表達(dá)量,Real-TimePCR用來(lái)檢測(cè)兩種細(xì)胞中外源基因的表達(dá)。結(jié)果表明,piggyBac轉(zhuǎn)座子能高效的介導(dǎo)外源基因在豬體細(xì)胞中的表達(dá),且表達(dá)量是隨機(jī)整合法的4倍。
　　 7為了檢測(cè)兩種細(xì)胞中外源基因的表達(dá)量差異是否和啟動(dòng)子的甲基化有差異,我們分析了細(xì)胞傳代過(guò)程中外源基因啟動(dòng)子CMV的甲基化變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種細(xì)胞中外源基因啟動(dòng)子的甲基化情況沒(méi)有改變。<

7、br>　　 8不同比例的、的轉(zhuǎn)座子供體質(zhì)粒和輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞并G418篩選10天后,統(tǒng)計(jì)每一組得到的陽(yáng)性細(xì)胞集落數(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),當(dāng)供體質(zhì)粒和輔助質(zhì)粒的比例在1:4之前時(shí),陽(yáng)性細(xì)胞集落數(shù)隨輔助質(zhì)粒量得增加而增加,但當(dāng)該比例到1:5的時(shí)候,陽(yáng)性細(xì)胞集落數(shù)顯著下降。
　　 9為了檢測(cè)piggyBac轉(zhuǎn)座酶對(duì)豬胎兒成纖維細(xì)胞增殖造成的影響,用CCK-8試劑盒檢測(cè)不同量得轉(zhuǎn)座酶對(duì)細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果表明piggyBac轉(zhuǎn)座酶影響豬胎兒成纖

8、維的增殖,尤其是當(dāng)轉(zhuǎn)座酶和pEGFP-C1質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞時(shí),細(xì)胞的增殖效率顯著下降。
　　 10攜帶有piggyBac轉(zhuǎn)座子和pEGFP-C1隨機(jī)整合的細(xì)胞作為核移植的供體細(xì)胞進(jìn)行核移植后,檢測(cè)核移植胚胎的卵裂率,囊胚率和囊胚細(xì)胞數(shù)。結(jié)果表明,無(wú)論是piggyBac轉(zhuǎn)座還是pEGFP-C1的隨機(jī)整合,核移植胚胎的卵裂率,囊胚率和囊胚細(xì)胞數(shù)都沒(méi)有顯著差異。表明piggyBac轉(zhuǎn)座不影響核移植胚胎的發(fā)育。
　　 11為了比較

9、兩種轉(zhuǎn)染體系在核移植胚胎中是否能有效介導(dǎo)外源基因的表達(dá),利用Real-TunePCR檢測(cè)了兩種供體細(xì)胞來(lái)源的核移植胚胎中的外源基因EGFP的表達(dá),結(jié)果表明piggyBac轉(zhuǎn)座子能高效介導(dǎo)外源基因的表達(dá),而且表達(dá)量是隨機(jī)整合體系介導(dǎo)的外源基因表達(dá)量得17倍。
　　 12在轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程中,follistatin表達(dá)的豬胎兒成纖維細(xì)胞發(fā)生了形態(tài)上的改變,細(xì)胞變長(zhǎng)變細(xì),并且可以呈克隆狀生長(zhǎng)。Follistatin的表達(dá)引起了豬胎