金魚Tgf2轉座子的研究及其轉基因應用.pdf

1、轉座子是基因組上的一段一定長度的DNA序列，能在自身編碼的轉座酶或逆轉錄酶的作用下，發(fā)生自我剪切或復制，并且在基因組DNA中移動位置的基本單位。如青鳉Tol2轉座子(TransposableelememofOryziaslatipes，number2)和鮭魚SB轉座子(SleepingBeautyTransposon)都以“剪切-粘貼”的方式進行轉座，即轉座酶對轉座子進行剪切，然后介導其插入到基因組內(nèi)部。研究證明Tol2轉座酶識別的是轉

2、座子末端反向重復序列和亞末端重復序列，當上述區(qū)域突變之后，其轉座效率會明顯下降。SB轉座酶識別的末端重復序列大約長230bp，由外側的反向重復序列(invertedrepeats，IR)和內(nèi)側的同向重復序列(directlyrepeats，DR)及兩者間的序列組成。根據(jù)它們的轉座機制，國外學者構建了基于Tol2和SB轉座子的轉基因系統(tǒng)，即轉基因供體質(zhì)粒加轉座酶輔助質(zhì)粒的轉基因體系。研究表明，兩個轉基因系統(tǒng)都具有廣泛的通用性，近幾年已在轉

3、基因、基因捕獲和基因治療研究中取得了重大進展。
　　 2008年，本實驗室在19種不同魚類物種或品系中進行PCR篩選，最后在我國金魚品系中發(fā)現(xiàn)了一個新的hAT家族轉座子，命名為金魚Tgf2轉座子。在此基礎上，本研究進一步采用cDNA末端快速擴增法(RACE)克隆了Tgf2轉座酶全長cDNA，并對其表達進行了RT-PCR和原位雜交研究；其后，對Tgf2轉座子的多態(tài)性進行了研究；最后，利用Tgf2轉座子的左右末端和轉座酶編碼框(CD

4、S)構建了具有自主知識產(chǎn)權的轉基因系統(tǒng)，并在斑馬魚、草魚、金魚和鯽魚等鯉科魚類中開展了轉基因研究。主要研究結果如下：
　　 1.Tgf2轉座酶全長cDNA的克?。汗部寺〉玫?種轉錄本，分別命名為gfTP-1、gfTP-2、gfTP-3、gfTP-4、gfTP-5、gfTP-6、gfTP-7；經(jīng)對其編碼框進行預測，發(fā)現(xiàn)金魚Tgf2轉座子能編碼產(chǎn)生3種長度的轉座酶，其編碼框長度分別為：2061bp(gfTP-1)、1953bp(gf

5、TP-2和gfTP-3)和1734bp(gfTP-4、gfTP-5、gfTP-6和gfTP-7)，分別編碼686個、650個和577個氨基酸殘基；金魚Tgf23種長度的轉座酶間的差異主要體現(xiàn)在5’端，與青鳉Tol2的3種轉座酶序列相比較，發(fā)現(xiàn)兩種魚類的轉座酶在序列上的相似度達99％，僅有7個氨基酸的差異。
　　 2.選取3種長度金魚Tgf2轉座酶mRNA的共有區(qū)設計引物，對金魚不同組織總RNA進行RT-PCR分析，結果顯示Tgf

6、2轉座酶基因在金魚所有組織均有表達，以卵巢中表達量最高，其次為肝臟。對金魚不同發(fā)育時期胚胎進行RT-PCR和整胚原位雜交分析，結果表明轉座酶基因的表達模式在不同個體問具有明顯時空差異。
　　 3.對珍珠、鶴頂紅、紅獅頭、花獅頭、琉金、蝶尾、龍睛、水泡眼和草金9個不同金魚品系的基因組進行PCR分析，發(fā)現(xiàn)Tgf2轉座子在金魚各品系中均有分布；并揭示了在金魚基因組中，Tgf2轉座子既有完整拷貝也有包含缺失的拷貝。
　　 4.克

7、隆了Tgf2轉座子的220bp左末端和185bp右末端序列，并以此構建了基于Tgf2轉座子的pTgf2-eflα-eGFP、pTgf2-krt8-eGFP和pTgf2-eflα-RFP轉基因供體質(zhì)粒；同時，利用Tgf2轉座酶1734bp的編碼區(qū)(編碼577個氨基酸殘基)構建了轉座酶輔助質(zhì)粒pCS2-gfTP。利用上述構建的轉基因供體質(zhì)粒和輔助質(zhì)粒系統(tǒng)，在模式生物斑馬魚和常見養(yǎng)殖鯉科魚類草魚、鯽魚及金魚中進行了轉基因研究。結果表明：Tgf