PB轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的雙干擾載體及卵巢特異性表達(dá)載體的構(gòu)建及其效果的研究.pdf

1、水牛是南方的重要品種資源，具有較強(qiáng)抗病抗逆耐粗的能力，而且水牛奶具有高蛋白高乳脂率的特征，將是南方鮮奶和高端奶的重要來源。我國政府大力支持在南方養(yǎng)殖奶水牛，然而水牛的繁殖性能較低，是水牛業(yè)發(fā)展的瓶頸問題。抑制素(Inhibin，INH)、卵泡抑素(Follistatin，F(xiàn)ST)對促卵泡素(Follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)具有反饋調(diào)控作用，從而在一定程度上影響卵巢功能及卵泡發(fā)育。目前已開展了許多有關(guān)IN

2、H或FST單個基因免疫和提高動物繁殖力的研究，并取得了較好的效果：利用轉(zhuǎn)基因和RNAi技術(shù)同時抑制INH和FST表達(dá)是否可以調(diào)控水牛卵巢功能和卵泡發(fā)育及提高繁殖性能，以及提高FSHp表達(dá)水平對生殖生理和繁殖性能的影響，這方面報(bào)道還不多。PiggyBac轉(zhuǎn)座子(PB)是一種DNA轉(zhuǎn)座子，已作為基因轉(zhuǎn)移和插入誘變等基因研究的有效工具，廣泛應(yīng)用于哺乳動物基因功能和轉(zhuǎn)基因的研究。本研究利用PB轉(zhuǎn)座系統(tǒng)，構(gòu)建了同時干擾INHA和FST的雙干擾載體

3、，在細(xì)胞水平分析表達(dá)和干擾效率、篩選穩(wěn)定整合的陽性細(xì)胞；構(gòu)建含有水牛卵巢特異性啟動子的FSHβ表達(dá)載體，分析其特異表達(dá)特性和表達(dá)效率。為水?；蚬δ堋⒙殉补δ芎吐雅莅l(fā)育調(diào)控機(jī)理及轉(zhuǎn)基因技術(shù)打下基礎(chǔ)。
　　 本研究的主要結(jié)果如下：
　　 (1)針對INHA和FST基因序列設(shè)計(jì)RNAi干擾片段，構(gòu)建了含有兩個轉(zhuǎn)錄元件的雙干擾載體pB-H1-shRNA1-U6-shRNA2。
　　 (2)比較分析了雙干擾載體的瞬時轉(zhuǎn)染

4、和與PB轉(zhuǎn)座酶共轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)染效率。分別利用瞬時轉(zhuǎn)染和共轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染水牛卵巢顆粒細(xì)胞(Buffalo fetal fibroblast cells，BuGCs)和水牛胎兒成纖維細(xì)胞(Buffalo fetal fibroblast cells，BuFFs)，分別統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)染第24h、48h和72h時載體中綠色熒光蛋白(GFP)在細(xì)胞中綠色熒光表達(dá)量。在轉(zhuǎn)染24h時瞬時轉(zhuǎn)染的細(xì)胞轉(zhuǎn)染率高于共轉(zhuǎn)染，而在其它時間共轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)染效率均高于瞬時轉(zhuǎn)染。

5、>　　 (3)證明了雙干擾載體pB-H1-shRNA1-U6-shRNA2對INHA和FST基因具有一定的抑制效果。通過Q-PCR檢測，細(xì)胞內(nèi)INHA和FST的mRNA的表達(dá)均因RNAi而有所減少，其中INHA在共轉(zhuǎn)染BuGCs時被干擾程度最大(37.37%)，其表達(dá)量顯著地低于空白對照組；在瞬時轉(zhuǎn)染黃牛卵巢顆粒細(xì)胞(Bovine granulosa cells，BGCs)中FST干擾率為3.55%。
　　 (4)篩選出了IN

6、HA和FST基因RNAi片段穩(wěn)定整合到基因組的陽性細(xì)胞。經(jīng)G418篩選轉(zhuǎn)染細(xì)胞，觀察熒光表達(dá)情況，轉(zhuǎn)染第7天后BuGCs和BuFFs熒光表達(dá)基本穩(wěn)定，并且通過PCR鑒定轉(zhuǎn)染后細(xì)胞基因組含有PB轉(zhuǎn)座子的序列。
　　 (5)構(gòu)建了分別含卵巢特異性啟動子CYP19、OSP-1(廣西大學(xué)惠贈)的pB-CYP19和pB-OSP1表達(dá)載體；
　　 (6)構(gòu)建了水牛FSHβ全長cDNA的卵巢特異表達(dá)的pB-CYP19-FSHβ和pB-

7、OSP1-FSHβ載體；
　　 (7)證明了兩個表達(dá)載體具有卵巢特異表達(dá)的特性，pB-OSP1-FSHβ載體超表達(dá)效率較高。將兩個載體分別轉(zhuǎn)染BuGCs和BuFFs，利用RT-PCR技術(shù)檢測出了BuGCs的FSHβ表達(dá)，而在BuFFs中卻沒有表達(dá)，證明了這兩個載體具有水牛卵巢特異表達(dá)特性；而且pB-OSP1-FSHβ載體的FSHβ表達(dá)效率(13.04%)高于pB-CYP19-FSHβ載體(1.2%)，故pB-OSP1-FSHβ載