KCN慢性毒性及神經(jīng)毒性機(jī)制研究.pdf

1、第一部分，KCN慢性毒性研究
　　 目的：觀察KCN連續(xù)灌胃對Wistar大鼠的慢性毒性反應(yīng)及其對各組織器官的損害程度、主要毒性靶器官及損害的可逆性，找到慢性毒性反應(yīng)的有效劑量，為慢性氰化物中毒提供數(shù)據(jù)。
　　 方法：健康Wistar大鼠60只按體重隨機(jī)分為對照組、低劑量組和高劑量組三組，每組20只，雌雄各半，按0mg/kg、5mg/kg、10mg/kg連續(xù)灌胃給藥14天，恢復(fù)期7天。每天測定代謝籠中動物的食量，在給藥第

2、7天、第14天、恢復(fù)期第7天測定動物的體重。在給藥第14天(d14，停藥期)和第21天(d21，恢復(fù)期)每組各1/2大鼠采血測定紅細(xì)胞計數(shù)、血紅蛋白定量、紅細(xì)胞壓積、紅細(xì)胞平均容積、紅細(xì)胞平均血紅蛋白容量、紅細(xì)胞平均血紅蛋白濃度、血小板計數(shù)、白細(xì)胞計數(shù)、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、大未染色細(xì)胞、網(wǎng)織紅細(xì)胞計數(shù)、凝血酶原時間、活化部分凝血活酶時間、凝血酶時間及血漿纖維蛋白原等血液學(xué)指標(biāo)以及血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移

3、酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、堿性磷酸酶、乳酸脫氫酶、總膽紅素、尿素氮、肌酐、總蛋白、白蛋白、血糖、總膽固醇、甘油三脂、肌酸磷酸激酶，血清鈣、磷、血清鉀、鈉和氯等血液生化指標(biāo)。在給藥第14天和第21天分別對每組各1/2的動物剖檢，進(jìn)行組織病理學(xué)檢查及骨髓細(xì)胞計數(shù)分類。
　　 結(jié)果：(1)給藥組大鼠在給藥后出現(xiàn)呼吸抑制、震顫等毒性反應(yīng)，高劑量組較為嚴(yán)重，但均在20-30分鐘內(nèi)恢復(fù)正常。(2)連續(xù)灌胃KCN14天對大鼠的體重沒有明顯影響。

4、(3)給藥后各組動物的進(jìn)食量沒有明顯變化。(4)KCN對大鼠的血液學(xué)指標(biāo)沒有明顯影響。(5)KCN對大鼠的血液生化指標(biāo)無明顯影響。(6)KCN給藥后，對大鼠的骨髓細(xì)胞沒有明顯影響。(7)停藥期時，高劑量組雌性大鼠腦組織的絕對重量及相對重量均顯著下降；部分高劑量組大鼠大腦皮質(zhì)層小膠質(zhì)細(xì)胞灶性增生，形成膠質(zhì)小結(jié)樣病變；灰白質(zhì)交界處個別神經(jīng)元細(xì)胞變性壞死，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞灶性浸潤填充；更有個別動物大腦白質(zhì)呈灶狀空泡樣變性，伴隨有髓纖維數(shù)量的減少；

5、部分動物甚至出現(xiàn)大腦基底部白質(zhì)的灶性脫髓鞘樣改變；少量動物海馬回神經(jīng)細(xì)胞銳減，甚至出現(xiàn)局灶性海馬神經(jīng)細(xì)胞大量脫落，且脫落區(qū)域可見大量神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞浸潤填充。其余臟器未見明顯異常。恢復(fù)期時未見明顯異常。
　　 結(jié)論：對大鼠連續(xù)14天的灌胃KCN試驗(yàn)，給藥組大鼠在給藥時出現(xiàn)嚴(yán)重的毒性反應(yīng)，毒性靶器官為中樞神經(jīng)系統(tǒng)，毒性作用可逆。
　　 第二部分KCN神經(jīng)毒性機(jī)制研究
　　 目的：結(jié)合KCN14天的灌胃試驗(yàn)，對Wista

6、r大鼠大腦組織進(jìn)行全基因組變化研究，找到KCN神經(jīng)毒性反應(yīng)可能涉及的信號通路；并對大鼠的血液和尿液進(jìn)行代謝組學(xué)分析，揭示KCN給藥對代謝產(chǎn)物的影響。
　　 方法：(1)基因組學(xué)研究：取12只大鼠(停藥期0mg/kg劑量組4只，停藥期10mg/kg劑量組4只，恢復(fù)期10mg/kg劑量組4只)的大腦組織，提取RNA，標(biāo)記并擴(kuò)增后與基因表達(dá)譜芯片進(jìn)行雜交，經(jīng)掃描分析篩選出給藥組與對照組表達(dá)差異的基因。(2)代謝組學(xué)分析：收集對照組、低

7、劑量組和高劑量組大鼠(每組8只)給藥第14天的尿液及血清樣本，做代謝組學(xué)分析。篩選出能體現(xiàn)KCN毒性的生物標(biāo)志物。
　　 結(jié)果：(1)芯片雜交信號清晰，背景低，信噪比高，基因芯片檢測和聚類分析結(jié)果有效。(2)經(jīng)過T-test檢驗(yàn)，篩選出顯著上調(diào)(信號比值≥2)或顯著下調(diào)(信號比值≤0.5)的差異表達(dá)基因289個。(3)按照基因功能分類體系(GeneOntology，GO)分析差異表達(dá)基因，結(jié)果顯示，差異基因體現(xiàn)的生物學(xué)功能多樣，

8、包括正向調(diào)節(jié)成神經(jīng)細(xì)胞的增殖、大腦皮層發(fā)育、負(fù)向調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞凋亡、正向調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、鈣離子應(yīng)答過程、動作電位的調(diào)節(jié)、細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)等。(4)導(dǎo)致KCN神經(jīng)毒性的可能信號通路有：粘著斑信號通路、多巴胺能突觸信號通路、谷氨酸能突觸信號通路、細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用信號通路、神經(jīng)受體配體相互作用信號通路、神經(jīng)營養(yǎng)因子信號通路、鈣信號通路。(5)代謝組學(xué)分析：高劑量組和低劑量組大鼠血清中磷酸膽堿，甘油磷酸膽堿，谷氨酰胺及甲基組氨酸的水平顯著升高，

9、賴氨酸的水平顯著降低。高劑量組和低劑量組大鼠尿液中氧化三甲胺，對羥基乙酸苯酯，羥丙茶堿，馬尿酸鹽，二甲胺水平相對溶媒對照組顯著增加，丁二酸，乳酸鹽，肌酸，瓜氨酸，乙酸鹽水平顯著降低。
　　 結(jié)論：(1)KCN的中樞神經(jīng)毒性作用可能和其以下特性有關(guān)：KCN神經(jīng)毒性的產(chǎn)生與神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)，Ca2+內(nèi)流有關(guān)；KCN對粘著斑信號通路和細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用信號通路的ITGB6有一定的調(diào)控作用，影響細(xì)胞與細(xì)胞間的相互作用；KCN對多

10、巴胺能突觸和谷氨酸能突觸信號通路中GRIN2A有一定的調(diào)控作用，影響神經(jīng)細(xì)胞間的突觸傳遞和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)；對神經(jīng)營養(yǎng)因子信號通路中NTRK2基因有一定的調(diào)控作用，影響神經(jīng)營養(yǎng)因子與酪氨酸激酶受體Trk的結(jié)合，進(jìn)而影響神經(jīng)細(xì)胞的功能。(2)KCN神經(jīng)毒性的產(chǎn)生，推測是有多條信號通路異常引起。其中最重要的機(jī)制可能是由于鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)，引發(fā)Ca2+內(nèi)流，導(dǎo)致生物膜脂質(zhì)過氧化，影響神經(jīng)細(xì)胞的突觸傳遞和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，產(chǎn)生CNS毒性。(3)大鼠代謝組學(xué)研究結(jié)果提