氟暴露所致大鼠發(fā)育神經(jīng)毒性和生殖毒性及其機(jī)制研究.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)方面展開論述:
　　第一部分 葡萄糖利用減少和神經(jīng)退行性改變參與氟暴露引起的大鼠認(rèn)知損傷
　　目的：氟是一種較活潑的微量元素，除了導(dǎo)致氟骨癥和氟斑牙、引起骨代謝紊亂外，還能對其它非骨相器官產(chǎn)生嚴(yán)重的損害。近年來，氟對神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育毒性引起了人們的廣泛關(guān)注，但其具體的作用機(jī)制還不十分清楚。本研究旨在探討氟暴露所致發(fā)育神經(jīng)毒性的潛在發(fā)生機(jī)制。
　　方法：將40只清潔級成年Sprague-Dewley（SD

2、）大鼠（雌雄各半）隨機(jī)分成四組：對照組（自來水，氟含量低于1mg/L）和25mg/L、50mg/L、100mg/L三個(gè)氟化鈉劑量組（氟化鈉溶解于自來水中），自由飲水染毒10天后，雌、雄大鼠按1﹕1合籠，受孕期間繼續(xù)按照上述劑量染毒至仔鼠斷乳（出生后第21天），將所有仔鼠按性別和劑量分開，接受與親代相同的染毒處理，到仔鼠出生后第8周末（出生后第56天）結(jié)束。采用Morris水迷宮檢測子代大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力；應(yīng)用小動(dòng)物磁共振成像（Mag

3、netic resonance imaging，MRI）技術(shù)觀察活體大腦形態(tài)學(xué)改變；小動(dòng)物正電子發(fā)射斷層顯像/計(jì)算機(jī)斷層掃描（Positron emission tomography/Computed tomography，PET/CT）活體檢測腦葡萄糖利用情況；電鏡下觀察海馬超微結(jié)構(gòu)改變；Western blot方法檢測腦功能相關(guān)基因葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（glucose transporter1，GLUT1）、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brai

4、n-derived neurotrophic factor，BDNF）以及膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）的蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：與對照組相比，25mg/L、50mg/L和100mg/L氟暴露均可明顯增加子代大鼠到達(dá)平臺(tái)的潛伏期和路徑，并顯著降低大鼠在平臺(tái)所在象限的游行時(shí)間（路徑）和總時(shí)間（總路徑）的比值，且各組內(nèi)雌雄之間無性別差異；MRI檢測結(jié)果顯示染氟大鼠側(cè)腦室T

5、2加權(quán)信號(hào)增強(qiáng)，提示染氟大鼠出現(xiàn)腦室擴(kuò)張；PET/CT成像檢測結(jié)果表明，50mg/L和100mg/L兩個(gè)染氟組子代大鼠腦葡萄糖利用率明顯降低；電鏡下超微結(jié)構(gòu)顯示氟可導(dǎo)致海馬CA1區(qū)大量空泡化形成、神經(jīng)元顯著變性并發(fā)生脫髓鞘改變；腦功能基因檢測發(fā)現(xiàn)，25mg/L、50mg/L和100mg/L氟處理均可明顯下調(diào)大鼠腦皮層和海馬GLUT1和GFAP的表達(dá)水平，并顯著上調(diào)皮層和海馬BDNF的表達(dá)水平，上述三個(gè)蛋白在相同暴露劑量的雌雄大鼠間的表達(dá)

6、水平相近。
　　結(jié)論：發(fā)育期氟暴露引起的神經(jīng)毒性與大腦葡萄糖利用減少和神經(jīng)退行性改變密切相關(guān)。
　　第二部分 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和炎癥反應(yīng)在氟暴露所致大鼠睪丸損傷中的作用
　　目的：長期過量氟暴露可對機(jī)體多種組織器官造成損傷。雖然氟對雄性生殖系統(tǒng)的損傷作用已被確認(rèn)并備受人們關(guān)注，但氟導(dǎo)致生殖毒性的具體作用機(jī)制還未完全闡明。本研究通過模擬人群氟暴露方式建立動(dòng)物氟暴露模型，旨在探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和炎癥反應(yīng)在氟暴露致子代大鼠睪丸損傷中的

7、作用。
　　方法：將40只清潔級成年Sprague-Dewley（SD）大鼠（雌雄各半）隨機(jī)分成四組：對照組（自來水，氟含量低于1mg/L）和25mg/L、50mg/L、100mg/L三個(gè)氟化鈉劑量組（氟化鈉溶解于自來水中），自由飲水染毒10天后，雌、雄大鼠按1﹕1合籠，受孕期間繼續(xù)按照上述劑量染毒至仔鼠斷乳（出生后第21天），將所有雄性仔鼠按與親代相同的染毒方式處理，到仔鼠出生后第8周末（出生后第56天）結(jié)束。應(yīng)用蘇木精—伊紅（

8、Hematoxylin-eosin staining，HE）染色、原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記（Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling，TUNEL）試驗(yàn)檢測睪丸組織形態(tài)改變及生殖細(xì)胞凋亡情況；電鏡下觀察睪丸超微結(jié)構(gòu)改變；采用比色法測定睪丸組織丙二醛（Methane dicarboxylic aldehyde，MDA）含量及超氧化物歧化

9、酶（Superoxide dismutase，SOD）活力；應(yīng)用Real time PCR檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子及促炎癥介質(zhì)的mRNA表達(dá)水平；Western blot技術(shù)檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志分子及核轉(zhuǎn)錄因子κB（nuclear factor-κB, NF-κB）的蛋白表達(dá)水平；免疫組織化學(xué)檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡調(diào)控分子生長抑制和 DNA損傷同源蛋白153(GADD153/C/EBPhomologous protein，CHOP）以及炎癥調(diào)控

10、因子NF-κB活化亞單位p65的表達(dá)和組織定位。
　　結(jié)果：與對照組相比，發(fā)育期氟暴露可導(dǎo)致明顯的睪丸組織病理學(xué)損傷，主要表現(xiàn)為：子代大鼠睪丸曲細(xì)精管萎縮，生精上皮松弛、結(jié)構(gòu)不完整，生殖細(xì)胞排列不規(guī)則，嚴(yán)重者甚至出現(xiàn)脫落，生殖細(xì)胞數(shù)量明顯減少。TUNEL染色檢測發(fā)現(xiàn)50mg/L和100mg/L染氟組睪丸出現(xiàn)不同程度的凋亡，主要以精原細(xì)胞和精母細(xì)胞凋亡為主。電鏡結(jié)果同時(shí)也發(fā)現(xiàn)生殖細(xì)胞出現(xiàn)核染色質(zhì)濃縮及邊集等典型的凋亡形態(tài)學(xué)特征，并可

11、見細(xì)胞空泡化改變；大量線粒體出現(xiàn)明顯的腫脹、擴(kuò)張，嵴斷裂甚至消失等異常形態(tài)；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)也呈極度的擴(kuò)張變性改變。生化分析結(jié)果表明氟能引起睪丸組織MDA蓄積以及SOD活力降低。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，25mg/L、50mg/L和100mg/L氟暴露能引起睪丸內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和未折疊蛋白反應(yīng)活化，誘導(dǎo)葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（Glucose-regulated protein78，GRP78）、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜感應(yīng)蛋白肌醇需求酶1（Inositol-requiring e

12、nzyme1，IRE1）及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡信號(hào)調(diào)控蛋白 CHOP的基因和蛋白表達(dá)，且CHOP的表達(dá)和組織分布與凋亡的生殖細(xì)胞大體一致。此外，25mg/L、50mg/L和100mg/L氟暴露還能不同程度的上調(diào)睪丸組織炎癥相關(guān)介質(zhì)如腫瘤壞死因子α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素1β（Interleukin-1β，IL-1β）、誘導(dǎo)型的一氧化氮合酶（Inducible nitric oxide syntha