神經(jīng)酰胺在頭頸部鱗狀細胞癌中作用和機制的研究.pdf

1、目的:
　　頭頸部惡性腫瘤是全世界常見的惡性腫瘤，其中以頭頸部鱗狀細胞癌為主，占了頭頸部惡性腫瘤的90％。雖然近年來以手術(shù)為主，輔以放化療的治療手段不斷提高，但頭頸部鱗癌的五年生存率仍無明顯提高，患者的生存質(zhì)量也無明顯改善。為了尋求頭頸部鱗癌新的發(fā)病機制和治療的研究方向，本文將研究C2-神經(jīng)酰胺在頭頸部鱗癌中對腫瘤細胞的保護和毒性作用及相關(guān)機制，以及與YAP蛋白表達的作用關(guān)系，以找尋頭頸部鱗癌疾病發(fā)生、發(fā)展過程中重要的蛋白分子，為

2、頭頸部鱗癌的治療研究提供理論基礎(chǔ)和新的發(fā)展方向，并有望發(fā)現(xiàn)新的治療靶點和治療方法。
　　方法:
　　1.采用C2-神經(jīng)酰胺與泛caspase抑制劑Z-VAD-FMK單獨或聯(lián)合處理頭頸部鱗癌細胞系，應(yīng)用光鏡和流式細胞術(shù)，觀察其誘導的頭頸部鱗癌細胞凋亡作用;應(yīng)用CCK-8實驗技術(shù)觀察其對頭頸部鱗癌細胞的增殖和活性的影響;通過蛋白免疫印跡法檢測cleaved caspase-3的蛋白表達變化水平，從而探討C2-神經(jīng)酰胺對頭頸部鱗癌

3、細胞的凋亡作用和相關(guān)的作用機制。
　　2.采用C2-神經(jīng)酰胺與壞死抑制劑Nec-1單獨或聯(lián)合處理頭頸部鱗癌細胞系，應(yīng)用DNA瓊脂糖電泳技術(shù)和免疫熒光技術(shù)，觀察其誘導的頭頸部鱗癌細胞程序性壞死的作用;應(yīng)用CCK-8實驗技術(shù)觀察其對頭頸部鱗癌細胞的增殖和活性的影響，從而驗證C2-神經(jīng)酰胺誘導頭頸部鱗癌細胞發(fā)生的程序性壞死作用。
　　3.采用C2-神經(jīng)酰胺處理頭頸部鱗癌細胞系，應(yīng)用電鏡、免疫熒光技術(shù)和蛋白免疫印跡法，觀察檢測自噬效

4、應(yīng)蛋白LC3-Ⅱ的表達和自噬泡的形成;聯(lián)合采用自噬抑制劑氯喹(CQ)處理細胞，應(yīng)用CCK-8實驗技術(shù)觀察聯(lián)合用藥前后對細胞增殖和活性的影響;聯(lián)合采用MEK抑制劑PD98059處理細胞，應(yīng)用蛋白免疫印跡法檢測自噬相關(guān)通路蛋白LC3B-Ⅱ、Beclin-1、p-ERK、p-AMPK、p-Akt、p-mTOR的表達水平，并應(yīng)用CCK-8實驗技術(shù)觀察抑制劑作用前后對細胞增殖和活性的影響，從而探討C2-神經(jīng)酰胺誘導的頭頸部鱗癌細胞發(fā)生自噬對細胞的

5、保護作用以及可能的機制和相關(guān)信號通路。
　　4.應(yīng)用免疫組化技術(shù)檢測60例頭頸部鱗癌組織標本和癌旁正常組織標本中YAP蛋白的表達水平，通過統(tǒng)計學處理，分析蛋白表達與腫瘤的病理分級、患者性別之間的相關(guān)性;同時采用C2-神經(jīng)酰胺處理頭頸部鱗癌細胞系，應(yīng)用蛋白免疫印跡法檢測YAP蛋白的表達變化水平，探討YAP蛋白與頭頸部鱗癌發(fā)病的相關(guān)性以及與C2-神經(jīng)酰胺的作用關(guān)系。
　　結(jié)論:
　　1.C2-神經(jīng)酰胺處理頭頸部鱗癌細胞后，

6、細胞活性和增殖能力受到顯著抑制，凋亡細胞明顯增加，但細胞內(nèi)cleaved caspase-3的蛋白表達水平無明顯變化，且Z-VAD-FMK對C2-神經(jīng)酰胺的促凋亡作用無顯著影響，提示了C2-神經(jīng)酰胺能有效誘導頭頸部鱗癌細胞發(fā)生非caspase-3依賴的細胞凋亡作用。
　　2.C2-神經(jīng)酰胺處理頭頸部鱗癌細胞后，細胞內(nèi)壞死細胞數(shù)明顯增加，而程序性壞死抑制劑能有效抑制C2-神經(jīng)酰胺處理后壞死細胞的產(chǎn)生并顯著抑制其誘導的細胞毒性作用，證

7、實了C2-神經(jīng)酰胺能有效誘導頭頸部鱗癌細胞發(fā)生程序性壞死作用，并協(xié)同其誘導的凋亡作用，實現(xiàn)了抗癌的效果，而程序性壞死抑制劑能有效減弱這一效果。
　　3.C2-神經(jīng)酰胺處理頭頸部鱗癌細胞后，細胞內(nèi)自噬泡數(shù)量和LC3-Ⅱ、p-ERK表達水平顯著升高，而自噬抑制劑和MEK抑制劑能有效抑制其誘導的自噬作用并進一步提升其對細胞活性和增殖的抑制作用，提示了C2-神經(jīng)酰胺能通過ERK1/2信號通路誘導細胞發(fā)生保護性自噬作用，且自噬抑制劑能有效抑