基于小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞MMP-9 RNAi的腫瘤靶向基因治療研究.pdf

1、腫瘤細(xì)胞有別于正常細(xì)胞的主要特性是生命力強(qiáng)、無(wú)限增殖、無(wú)接觸抑制性并且具有局部浸潤(rùn)和遷移遠(yuǎn)端的能力，特別是惡性腫瘤的侵襲特性，其對(duì)遠(yuǎn)端組織器官的侵襲破壞往往是惡性腫瘤導(dǎo)致患者死亡的關(guān)鍵原因。常規(guī)的腫瘤治療策略對(duì)控制原位腫瘤的增殖生長(zhǎng)能夠起到一定的作用，但是對(duì)腫瘤細(xì)胞遷移侵襲能力的抑制任然十分有限。腫瘤轉(zhuǎn)移是多種轉(zhuǎn)移相關(guān)因子共同作用的結(jié)果，惡性瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移早期的重要事件就是對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)(extra cellular matrix，ECM)的

2、降解，基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)可以水解不同類型的膠原蛋白、纖粘連蛋白、層粘連蛋白，在ECM降解，瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。MMP-9是MMP家族的主要成員，也稱為明膠酶B，水解基底膜中的Ⅳ型膠原，刺激腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移，甚至能通過(guò)調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)來(lái)調(diào)節(jié)腫瘤血管生成。
　　 惡性黑色素瘤(malignant melanoma，MM)是免疫原性最強(qiáng)

3、的腫瘤之一，是研究免疫治療、基因治療的首選腫瘤模型。第一例惡性腫瘤的基因治療就針對(duì)于晚期黑色素瘤。Rosenberg小組將腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)基因經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在體外轉(zhuǎn)染來(lái)進(jìn)行晚期黑色素瘤的治療。RNA干擾(RNAinterference，RNAi)是有效雙鏈RNA引起的轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post-transcriptionalgene silencing，PTGS)現(xiàn)象，為抑制mRNA分子

4、合成蛋白提供了快速而相對(duì)簡(jiǎn)便的途徑。伴隨RNAi技術(shù)的完善，RNAi技術(shù)已經(jīng)運(yùn)用于腫瘤的基因治療。因此，本研究使用RNAi技術(shù)靶向沉默小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞中的MMP-9，理論上具有抑制腫瘤增殖轉(zhuǎn)移的可行性。
　　 研究目的
　　 1.篩選B16細(xì)胞MMP-9基因干擾序列；
　　 2.探究體外干擾MMP-9對(duì)B16小鼠黑色素瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響；
　　 3.體內(nèi)研究干擾MMP-9對(duì)C57BL/6小鼠惡性黑

5、色素瘤侵襲轉(zhuǎn)移的影響。
　　 研究方法
　　 1.針對(duì)小鼠MMP-9尋找干擾靶位點(diǎn)，針對(duì)靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)shRNA干擾序列，用pGensil-1質(zhì)粒為基本質(zhì)粒結(jié)構(gòu)，在其U6 Promoter和CMV Promoter之間插入針對(duì)MMP-9的不同RNA干擾序列，構(gòu)建干擾載體。使用陽(yáng)離子復(fù)合物轉(zhuǎn)染試劑將干擾載體轉(zhuǎn)染進(jìn)入B16細(xì)胞，流式細(xì)胞技術(shù)測(cè)定轉(zhuǎn)染效率，激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)及熒光表達(dá)情況，實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)每種載

6、體的干擾效果，優(yōu)選干擾載體；
　　 2.使用優(yōu)選的MMP-9干擾載體在體外水平干擾B16細(xì)胞的MMP-9，Westernblotting實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞表達(dá)MMP-9蛋白變化，Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)干擾MMP-9后B16細(xì)胞遷移能力、侵襲能力的變化；
　　 3.以小鼠爪墊皮下移植法建立C57小鼠黑色素瘤侵襲模型，繼而采用局部瘤體注射針對(duì)MMP-9基因的RNA干擾復(fù)合物給予病鼠基因治療，評(píng)估治療效果。
　　 研究結(jié)

7、果
　　 1.構(gòu)建了p-9-RNAi-1＃，2＃，3＃三種干擾載體。在轉(zhuǎn)染效率保證的基礎(chǔ)上，定量PCR檢測(cè)表明2＃載體在24h到48h整個(gè)過(guò)程中表現(xiàn)出持續(xù)的干擾效力并呈現(xiàn)出上升趨勢(shì)，從32％到達(dá)63％，是三者中最優(yōu)干擾載體；
　　 2.RNAi沉默MMP-9后，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組MMP-9蛋白質(zhì)水平?jīng)]有檢測(cè)到明顯的差異性，但是體外遷移侵襲中干擾組的遷移侵襲能力明顯下降；
　　 3.對(duì)小鼠足墊模型原位瘤給予局部瘤體注射