CYP4A11和CYP4F2基因多態(tài)性與原發(fā)性高血壓和冠心病的相關研究.pdf

1、研究目的：
　　 高血壓(Hypertension)是一種以動脈血壓持續(xù)升高為主要特征的慢性疾病，其病理過程常涉及動脈血管壁增厚、心肌纖維化、左室肥大和腎血管硬化等，可引起高血壓靶器官的損害，是腦卒中、心肌梗死、充血性心力衰竭和高血壓性腎病發(fā)病、死亡的主要危險因素。高血壓根據(jù)病因可分為原發(fā)性和繼發(fā)性兩類，繼發(fā)性高血壓是由某些確定的疾病或病因（如腎臟疾病、內(nèi)分泌疾病、心血管病變、顱腦病變等）引起的血壓升高，約占所有高血壓的5％;在

2、絕大多數(shù)患者中，高血壓的病因不明，稱為原發(fā)性高血壓(essentialhypertension，EH)，約占全部高血壓患者的95％以上，通常簡稱為高血壓。冠狀動脈粥樣硬化性心臟病指冠狀動脈粥樣硬化使血管狹窄或阻塞，或（和）因冠狀動脈功能性改變（痙攣）導致心肌缺血缺氧或壞死而引起的心臟病，簡稱冠心病(coronaryheartdisease，CHD)，亦稱缺血性心臟病，包括心絞痛和心肌梗死。冠心病是動脈粥樣硬化導致器官病變的最常見類型，也

3、是嚴重危害人民健康的常見病。
　　 世界衛(wèi)生組織(WHO)的調(diào)查報告顯示，冠心病至今仍是人類死亡的主要原因之一，且發(fā)病率逐年上升，其治療尤其是預防顯得極為重要。肥胖、血脂異常、高血壓、糖尿病、吸煙、飲酒等一些傳統(tǒng)危險因素與冠心病的發(fā)生有關，其預防主要是對各種危險因素進行控制，而原發(fā)性高血壓是冠心病的重要危險因素之一，其發(fā)生與冠心病密切相連，有效預防高血壓也因此備受關注。高血壓的傳統(tǒng)危險因素包括高鹽飲食、抽煙、飲酒和長期精神緊張等

4、。EH和CHD都是遺傳和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果，是多基因相關疾病，具有明顯的家族聚集性，遺傳因素在其發(fā)病起重要作用。隨著分子生物學的迅速發(fā)展及人類基因組計劃的進行，尋找心血管疾病易感基因并從基因水平闡明其發(fā)病機制成為醫(yī)學研究的熱點。大規(guī)模篩查EH和CHD易感人群，實施有效預防措施，對延緩或防止心血管疾病的發(fā)生發(fā)展具有重要意義。
　　 研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性花生四烯酸(Arachidonicacid，AA)及其代謝產(chǎn)物對心血管系統(tǒng)具有重要

5、的調(diào)節(jié)作用。早期研究發(fā)現(xiàn)AA主要由環(huán)氧化酶(cyclooxygenase，COXs)和脂質(zhì)氧化酶(lipoxygenase，LOXs)代謝，后研究發(fā)現(xiàn)AA還可通過細胞色素P450表氧化酶和ω-羥化酶代謝，分別生成表氧化二十碳三烯酸（epoxyeicosatrienoicacids，EETs）和羥化二十碳四烯酸(hydroxyeicosenoicacids，HETEs)。20-HETE是腎、腦、腸系膜和骨骼肌小動脈的強效收縮劑，在腎臟中又

6、能促進尿鈉排泄，具有升壓和降壓雙重作用;還能抑制血管內(nèi)皮超極化因子介導的冠脈舒張，加重冠脈缺血引起的心肌損傷程度。在不同病理狀態(tài)下，20-HETE在心血管功能的改變中發(fā)揮重要作用，參與EH、CHD等心腦血管疾病的發(fā)生發(fā)展。
　　 細胞色素P450(cytochromeP450，CYP)是最重要的微粒體混合功能氧化酶，參與體內(nèi)外眾多物質(zhì)的生物轉(zhuǎn)化，主要包括CYP1～4家族和A、B、C、D、E、F等亞家族。CYP同工酶在腎臟、肝臟、

7、心臟、血管內(nèi)皮和平滑肌等多種組織中表達，其中CYP4A11和CYP4F2是代謝AA的重要ω-羥化酶，能夠代謝AA生產(chǎn)20-HETE。CYP4A11定位于染色體1p33，長約12.57kbp，有12個外顯子和11個內(nèi)含子，編碼519個氨基酸;CYP4F2定位于染色體19p13.11，長約20kbp，由13個外顯子和12個內(nèi)含子組成，編碼520個氨基酸。CYP4A11和CYP4F2這兩個基因的突變位點很多且具有明顯的種族差異，在中國漢族人群

8、中普遍存在且具有功能意義的突變主要是-845A＞G(rs9332978)、-296C＞T、8590T＞C（rs1126742）及CYP4F2rs2108622和rs1558139，研究發(fā)現(xiàn)這些位點可能與原發(fā)性高血壓和冠心病具有相關性，但未得出一致結(jié)論，因此研究中國人CYP4A11和CYP4F2基因多態(tài)性與高血壓和冠心病的相關性具有重要的科學價值和廣泛的社會效益。本研究通過病例-對照法探討了CYP4A11的-845A＞G、-296C＞T、

9、8590T＞C和CYP4F2rs1558139基因多態(tài)性與中國漢族人群原發(fā)性高血壓和冠心病的易感性。
　　 研究對象：
　　 所有原發(fā)性高血壓和冠心病病人均為廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院住院病人，對照組為同期在健康體檢中心體檢的人。其中原發(fā)性高血壓患者132例，冠心病患者168例，原發(fā)性高血壓和并冠心病患者196例，對照者297例。經(jīng)統(tǒng)計學分析各病例組與對照組年齡、性別、吸煙率、飲酒率等條件具有可比性。
　　 1.EH患者

10、入選標準:
　　 納入標準:根據(jù)美國JNC7及2003年ESH/ESC歐洲高血壓指南標準，即坐位時收縮壓/舒張壓≥140/90mmHg(1mmHg=0.133kPa)，且在第1次診斷后的2個月內(nèi)3次偶測血壓均符合上述標準，已確診為原發(fā)性高血壓;或目前正在服用降壓藥物者。
　　 排除標準:1)繼發(fā)性高血壓;
　　 2)肝腎移植患者或肝腎功能不全者;
　　 3)腦卒中患者;
　　 4)患有惡性腫瘤患者

11、;
　　 5)患有糖尿病、甲狀腺疾病等其它內(nèi)分泌代謝疾病及其它嚴重的全身性疾病患者;
　　 6)未進行有效避孕的育齡婦女、妊娠和哺乳期婦女。
　　 2.CHD患者入選標準:
　　 納入標準:經(jīng)冠脈造影冠脈狹窄≥50％確診為冠心病者;或有典型心絞痛史患者。
　　 排除標準:1）肝腎移植患者或肝腎功能不全者;
　　 2)腦卒中患者;
　　 3)患有惡性腫瘤患者;
　　 4)患有

12、糖尿病、甲狀腺疾病等其它內(nèi)分泌代謝疾病及其它嚴重的全身性疾病患者;
　　 5)未進行有效避孕的育齡婦女、妊娠和哺乳期婦女。
　　 3.健康受試者入選標準:
　　 納入標準:1）排除高血壓病和冠心病;
　　 2)血常規(guī)、尿常規(guī)、凝血功能、胸部X光及血生化、心電圖檢查正常，無肝腎疾病;
　　 3)無惡性腫瘤;
　　 4)無糖尿病、甲狀腺疾病等內(nèi)分泌代謝疾病及其它嚴重的全身性疾病;
　　

13、 5)無妊娠計劃或正在哺乳的婦女。
　　 研究方法：
　　 實驗對象空腹8小時以上，取靜脈血采用標準酶比色法測定總膽固醇(totalcholesterol，TC)、甘油三脂(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白膽固醇(lowdensitylipoproteincholesterol，LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(highdensityliproteineholesterol，HDL-C)。另取5ml靜脈血置

14、于EDTA-K2抗凝管中，按人血液DNA提取試劑盒操作步驟提取白細胞基因組DNA，所提DNA采用高分辨率熔解曲線(highresolutionmelting，HRM)分析法進行基因型分析。
　　 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行處理，計量資料用均數(shù)±標準差((x-)±s)表示，采用兩樣本t檢驗比較高血壓組和對照組符合正態(tài)分布的計量資料;等位基因頻率是否符合Hardy-Weinberg平衡定律和基因型頻率和等位基因頻率分析應

15、用卡方檢驗，危險因素分析采用多元logistic回歸分析;連鎖不平衡分析(LD)用Haploview4.2軟件，單體型分析應用R2.14.2分析軟件;以雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)果：
　　 1.本研究建立了一種操作簡便、成本低、通量高、速度快、靈敏度高、特異性強的高分辨率熔解曲線(highresolutionmelting，HRM)分析法檢測CYP4A11-845A＞G、-296C＞T、8590T＞C

16、和CYP4F2rs1558139基因型，該HRM分析法實現(xiàn)了真正的閉管操作，減少交叉污染。
　　 2.采用HRM分析法對328例無血緣關系的原發(fā)性高血壓患者及297例健康對照者進行CYP4A118590T＞C、-296C＞T、-845A＞G和CYP4F2rs1558139基因分型，結(jié)果顯示:CYP4A118590C、-296T、-845G和CYP4F2rs1558139T等位基因在中國漢族原發(fā)性高血壓人群中的分布頻率分別為0.2

17、65、0.085、0.168和0.291，其中CYP4A11-845G等位基因頻率與對照組有差異(P=0.049)。采用logistic回歸分析排除傳統(tǒng)危險因素的影響，對于全體，CYP4A11-845A＞G顯性模型(AAversusAG+GG)仍存在顯著性差異(P=0.031)。對于女性，高血壓組和對照組CYP4A118590T＞C、-296C＞T和-845A＞G的顯性模型(分別為TTversusTC+CC、CCversusCT+TT和

18、AAversusAG+GG)仍然有差異，P值分別為0.032、0.020和0.045;高血壓組的T-C-G單體型頻率顯著高于對照的T-C-A單體型(P=0.016)，其發(fā)病率提高了1.909倍。
　　 3.采用HRM分析法對364例（其中196例患有原發(fā)性高血壓?。o血緣關系的冠心病患者及年齡和性別相匹配的429例（其中132例患有原發(fā)性高血壓病）健康對照者進行CYP4A118590T＞C、-296C＞T、-845A＞G和CYP

19、4F2rs1558139基因分型，結(jié)果顯示:CYP4A118590C、-296T、-845G和CYP4F2rs1558139T等位基因在中國漢族冠心病人群中的分布頻率分別為0.276、0.076、0.176和0.372。采用logistic回歸分析排除傳統(tǒng)危險因素的影響，對于全體，冠心病組和對照組的CYP4A11-845A＞G顯性模型(AAversusAG+GG)仍存在顯著性差異(P=0.026)。對于女性，冠心病組和對照組的CYP4A

20、11-845A＞G顯性模型(AAversusAG+GG)存在顯著性差異(P=0.045)。冠心病組和對照組CYP4A11-845A＞G的基因型（AAversusAGversusGG）存在差異(P=0.034)，但顯性模型(AAversusAG+GG)差異則消失(P=0.125)。
　　 冠心病組和對照組都排除高血壓病患者后，采用logistic回歸分析排除傳統(tǒng)危險因素的影響，對于全體，冠心病組和對照組的CYP4A11-845A＞

21、G顯性模型(AAversusAG+GG)仍存在顯著性差異(P=0.039);對于女性，冠心病組和對照組CYP4A11-845A＞G的基因型（AAversusAGversusGG）差異則消失(P=0.073)。單體型分析結(jié)果顯示冠心病組的T-C-G單體型頻率顯著高于對照的T-C-A單體型(P=0.021)，其發(fā)病率提高了1.633倍。
　　 結(jié)論：
　　 1.CYP4A11-845A＞G位點的AG+GG基因型增加中國漢族原

22、發(fā)性高血壓病的風險，與男性不相關，與女性相關。
　　 2.CYP4A118590T＞C和-296C＞T基因多態(tài)性與原發(fā)性高血壓的相關性與性別有關，8590TC+CC和-296CT+TT增加女性人群患病風險。
　　 3.CYP4A118590T＞C、-296C＞T和-845A＞G三個SNPs建立單體型，高血壓組的T-C-G單體型頻率顯著高于對照T-C-A單體型，其發(fā)病率提高了1.909倍。
　　 4.CYP4A11