應用雙砷熒光標記法觀察乙肝病毒核心蛋白細胞內轉運的實驗研究.pdf

1、乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus，HBV）感染嚴重危害人類健康，它是當今世界上引起急性肝功能衰竭、慢性活動性肝炎、肝硬化甚至肝癌等肝臟疾病的重要原因之一。乙肝病毒在分類上歸屬于嗜肝DNA病毒家族，其核心蛋白（HBV core protein，HBc），不僅構成病毒的蛋白質衣殼，同時也是診斷HBV感染的重要血清學標志。在HBV感染過程中，HBc發(fā)揮著多種生物學功能，除了包裝病毒前基因組RNA與聚合酶蛋白形成核衣殼外，它還參

2、與調節(jié)病毒DNA的復制，病毒顆粒的成熟，核衣殼與包膜蛋白的識別及病毒分泌等過程。盡管研究者們已經獲取了較多關于核心蛋白結構與功能的信息，但是有關核心蛋白及核心顆粒在細胞內轉運的研究卻仍有待深入。
　　 【目的】研究半胱氨酸短肽序列Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys 插入HBV核心蛋白主要免疫顯性區(qū)c/e1位點附近后對病毒核心蛋白表達及病毒顆粒形成的影響，探討利用雙砷化合物ReAsH標記法示蹤核心蛋白在細胞內轉運的可行

3、性，為運用此技術在活細胞中觀察HBV病毒顆粒的動態(tài)轉運過程提供實驗基礎。
　　 【方法】運用PCR及分子克隆技術，在質粒pTHBV1.3的C基因區(qū)引入編碼半胱氨酸短肽的寡核苷酸序列，將所得質粒命名pTHBV1.3-TC。應用脂質體Lipofectamine2000將pTHBV1.3-TC與pTHBV1.3分別瞬時轉染入HepG2細胞株。轉染48 h后，Western Blot，免疫熒光檢測核心蛋白表達；透射電鏡觀察HBV病毒顆粒

4、的形成。細胞轉染pTHBV1.3-TC36 h后，對細胞進行雙砷ReAsH標記，運用Olympus FV-500激光掃描共聚焦顯微鏡進行熒光淬滅恢復試驗(Fluorescence Recovery After Photobleaching，F(xiàn)RAP)以檢測核心蛋白在細胞內的轉運情況。
　　 【結果】酶切鑒定和DNA測序表明，編碼TC嵌合型核心蛋白（tetracysteine-tagged HBV core protein，TC-

5、HBc）的HBV表達載體pTHBV1.3-TC構建成功。將質粒pTHBV1.3和pTHBV1.3-TC分別轉染細胞后，Western Blot檢測顯示野生型和突變型核心蛋白均有表達，且兩種蛋白瞬時表達的水平沒有明顯差別（t=0.157，P=0.88）；免疫熒光檢測進一步驗證了兩種蛋白的表達，但野生型核心蛋白（wild type HBV core protein，WT-HBc）與TC嵌合型核心蛋白相比表現(xiàn)為更為明顯的核定位。投射電鏡觀察，

6、在瞬時轉染了pTHBV1.3-TC的細胞胞漿漿及培養(yǎng)上清中均發(fā)現(xiàn)40 nm的病毒樣顆粒，且上清中還存在20 nm左右的球形顆粒。FRAP結果得到TC-HBc在細胞內移動分數(shù)（mobile fraction，Mf）Mf=66.9%。
　　 【結論】半胱氨酸短肽標簽（tetracysteine tag，TC tag）在插入HBV核心蛋白免疫顯性區(qū)域（MIR）c/e1位點附近后，對蛋白的表達及病毒顆粒的組裝無顯著影響，說明TC序列可在