尿酸輔助樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)抗乙肝病毒免疫效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　 研究尿酸(uric acid，UA)聯(lián)合HBsAg負(fù)載的樹突狀細(xì)胞疫苗接種小鼠后產(chǎn)生的抗乙肝病毒(HBV)免疫效應(yīng)，包括HBsAg特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)殺傷效應(yīng)，T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)，Th1/Th2型細(xì)胞因子的分泌等。并對(duì)尿酸促進(jìn)DC成熟與功能提高的機(jī)理進(jìn)行探討。
　　 方法：
　　 1.體外分離小鼠骨髓細(xì)胞，使用rmGM-CSF、rmIL-4誘導(dǎo)分化為DC，以UA或LPS刺激其成熟。分不同劑

2、量尿酸組(70μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml)，LPS組、RMPI-1640培養(yǎng)基對(duì)照組。用流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測 DC細(xì)胞表面分子CD11c、CD83、CD86、IA/IE的表達(dá)，用MTT法檢測DC刺激同基因小鼠T淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)；ELISA法測定 DC上清 IL-12p70的分泌水平。
　　 2.尿酸體外刺激未成熟 DC48小時(shí)，提取 DC總RNA。RT-PCR方法檢測TLR2 mRNA、TL

3、R3 mRNA、TLR4 mRNA、IL-12p70 mRNA等的表達(dá)。
　　 3.使用尿酸或聯(lián)合抑制劑(p38 MAPK 抑制劑 SB203580、ERK1/2 抑制劑 PD98059、JNK 抑制劑SP600125、NF-κB 抑制劑 PDTC)體外刺激未成熟 DC。在 0min、15 min、30 min、45 min 時(shí)，分別提取DC細(xì)胞總蛋白與核蛋白。免疫印跡方法檢測 DCp-p38、p-ERK1/2、p-JNK、NF

4、-κB p65表達(dá)量。分別使用SB203580、PD98059、SP600125、PDTC與尿酸聯(lián)合刺激DC48h 后，收集細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測DC細(xì)胞表面分子CD83、CD86、IA/IE的表達(dá)；收集DC培養(yǎng)上清，ELISA法測定IL-12p70的水平。
　　 4.DC體外負(fù)載HBsAg，聯(lián)合尿酸接種正常BALB/c小鼠。尾靜脈注射方式接種，DC接種數(shù)量為1×106/每只小鼠，每周接種一次，共兩次。分高、中、低劑量(分別

5、為400μg、200μg、100μg)尿酸聯(lián)合HBsAg-DC組、負(fù)載或未負(fù)載HBsAg的DC單獨(dú)接種組、尿酸單獨(dú)接種組(200μg)及PBS對(duì)照組。同時(shí)以負(fù)載HBS28-39的DC單獨(dú)或聯(lián)合尿酸免疫小鼠，作為平行對(duì)照觀察組。一周和兩周時(shí)，以體內(nèi)熒光測定CTL活性方法，用流式細(xì)胞儀檢測特異性CTL活性；免疫兩周時(shí)，取小鼠脾T淋巴細(xì)胞，CFSE染色，體外以HBsAg或HBS28-39刺激培養(yǎng) 72h 后，流式細(xì)胞儀測定其增殖反應(yīng)；取小鼠脾

6、淋巴細(xì)胞體外HBsAg或HBS28-39刺激培養(yǎng) 72h 后，以ELISA法測定細(xì)胞上清IL-4和 IFN-γ的分泌水平。
　　 結(jié)果：
　　 1.通過鑒定體外成功誘導(dǎo)培養(yǎng)出DC。尿酸濃度為400μg/ml、200μg/ml、100μg/ml時(shí)能增強(qiáng)DC細(xì)胞表面CD83、CD86、IA/IE分子表達(dá)率；提高IL-12p70分泌水平(與陰性對(duì)照組相比，P＜0.05)；尿酸能增強(qiáng)DC刺激T細(xì)胞增殖能力(與陰性對(duì)照組相比，P值

7、均小于 0.05)；尿酸濃度為70μg/ml時(shí)，細(xì)胞表面分子表達(dá)、IL-12p70分泌水平、刺激T細(xì)胞增殖作用與陰性對(duì)照組比較均無明顯差別(P＞0.05)。UA促進(jìn)DC成熟的能力呈尿酸劑量依賴性增強(qiáng)。
　　 2.RTPCR結(jié)果示 尿酸組與培養(yǎng)基對(duì)照組相比，TLRs mRNA 表達(dá)出現(xiàn)明顯的變化。TLR2 mRNA、TLR3 mRNA、TLR4 mRNA表達(dá)下降(P＜0.05)，以TLR4 mRNA下降最明顯；IL-12p70表達(dá)

8、顯著增高(P＜0.05)；與LPS組相比，TLRs mRNA與IL-12p70 mRNA表達(dá)水平相似，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＞0.05。
　　 3.(1)免疫印跡示，尿酸刺激后，15min時(shí)，p-p38、p-ERK1/2、p-JNK、NF-κB表達(dá)量明顯增加，30min時(shí)達(dá)到最大值，45min時(shí)則開始下降，與 DMSO對(duì)照組相比，P值均小于 0.05。使用相應(yīng)抑制劑后，相關(guān)蛋白表達(dá)表不能測出。LPS組上述分子在45min時(shí)仍大量表達(dá)。

9、
　　 (2)與未用相應(yīng)抑制劑相比，使用SB203580、SP600125、PDTC 等抑制劑預(yù)處理后，CD83、CD86、IA/IE表達(dá)及IL-12p70分泌水平均出現(xiàn)下降(P＜0.05或0.01)，其中，以SB203580的作用最明顯；使用PD98059后，CD83、CD86、IA/IE 表達(dá)及IL-12p70分泌水平則出現(xiàn)上升(P＜0.05)。
　　 4.(1)免疫后一周或兩周，HBsAg特異性CTL，以負(fù)載HBs

10、Ag的DC聯(lián)合尿酸(400μg、200μg、100μg)接種組殺傷效應(yīng)最強(qiáng)，400μg尿酸聯(lián)合組一周時(shí)為32.45[％]±11.63[％]，兩周時(shí)為74.56[％]±12.38[％]；與DC對(duì)照組相比，均具有顯著性差異，P＜0.05。DC對(duì)照組殺傷效應(yīng)，一周時(shí)為14.33[％]±2.04[％]，兩周時(shí)為28.18[％]±2.38[％]，與其它對(duì)照組相比，均具有顯著性差異，P＜0.05；單獨(dú)尿酸免疫組、unpulsed-DC組的HBsAg

11、特異性CTL 殺傷效應(yīng)與PBS對(duì)照組無顯著性差異，P＞0.05。HBsAg負(fù)載的DC免疫各組與HBS28-39負(fù)載各組，特異性CTL殺傷效應(yīng)，無明顯差異，P＞0.05。荷肽或抗原DC免疫產(chǎn)生的特異性CTL殺傷效應(yīng)呈尿酸劑量依賴性升高，與尿酸的接種次數(shù)亦有關(guān)。
　　 (2)免疫后兩周，脾臟t細(xì)胞增殖反應(yīng)，以負(fù)載 HBsAg-DC聯(lián)合尿酸(400μg、200μg、100μg)接種組最強(qiáng)，P-I值為1.764±0.114；與DC對(duì)照組

12、相比，均具有顯著性差異，P＜0.05。DC對(duì)照組脾臟T細(xì)胞增殖反應(yīng)，PI值為1.342±0.093，與其它對(duì)照組相比，均具有顯著性差異，P＜0.05；單獨(dú)尿酸免疫組、unpulsed-DC組，脾臟T細(xì)胞增殖反應(yīng)與正常對(duì)照組無顯著性差異，P＞0.05。HBsAg負(fù)載的DC免疫各組與HBS28-39負(fù)載DC免疫各組，脾臟T細(xì)胞增殖反應(yīng)，無明顯差異，P＞0.05。荷肽或抗原DC免疫后脾臟T細(xì)胞增殖反應(yīng)呈尿酸劑量依賴性升高。
　　 (3

13、)免疫后兩周，負(fù)載HBsAg的DC聯(lián)合尿酸(400μg、200μg、100μg)接種組IFN-γ水平最高，IL-4水平最低，與DC對(duì)照組相比，均具有顯著性差異，P＜0.05；400μg尿酸聯(lián)合HBsAg-DC免疫組IFN-γ、IL-4水平分別為552.361±24.034 pg/ml，14.265±1.333 pg/ml。DC對(duì)照組脾臟細(xì)胞IFN-γ水平和IL-4水平，高于其它對(duì)照組，分別為266.575±51.324 pg/ml，22

14、.385±2.252 pg/ml(P＜0.05)；單獨(dú)尿酸免疫組、unpulsed-DC組，脾臟細(xì)胞IFN-γ水平和IL-4水平與正常對(duì)照組相比無明顯變化(P＞0.05)。HBsAg負(fù)載的DC免疫各組和HBS28-39負(fù)載各組，IFN-γ和IL-4水平，無明顯差異，P＞0.05。荷肽或抗原DC免疫后脾臟細(xì)胞分泌的IFN-γ和IL-4水平呈尿酸劑量依賴性。
　　 結(jié)論：
　　 1.對(duì)體外培養(yǎng)誘導(dǎo)擴(kuò)增的DC，尿酸可促進(jìn)其成熟

15、，提高表面共刺激分子表達(dá)；能增強(qiáng)其刺激T細(xì)胞增殖能力和分泌IL-12p 70的水平。UA的這些活性呈劑量依賴性。
　　 2.尿酸能調(diào)節(jié)未成熟樹突細(xì)胞 TLR2 mRNA、TLR3 mRNA、TLR4 mRNA 等受體 mRNA 及IL-12 p70 mRNA表達(dá)。此可能為其誘導(dǎo) DC成熟及免疫功能提高的機(jī)理之一。
　　 3.未成熟樹突狀細(xì)胞 p38、ERK1/2、PI3K、NF-κB等信號(hào)分子可由尿酸刺激磷酸化，相應(yīng)信號(hào)

16、分子抑制劑可抑制尿酸這種刺激作用。阻斷相應(yīng)上述信號(hào)分子通路，可對(duì)尿酸誘導(dǎo)的樹突狀細(xì)胞活性產(chǎn)生影響。阻斷p38、JNK、NF-κB等信號(hào)通路能抑制尿酸對(duì)樹突狀細(xì)胞CD83、CD86、IA/IE等分子表達(dá)及IL-12p 70分泌的上調(diào)作用；阻斷ERK1/2信號(hào)通路能增強(qiáng)尿酸對(duì)樹突狀細(xì)胞CD83、CD86、IA/IE等分子表達(dá)及IL-12p 70分泌的上調(diào)作用。尿酸可以調(diào)節(jié)P38、ERK1/2、JNK、 NF-κB等信號(hào)分子的活化，從而促進(jìn)D