PRRSV與PCV2的分子流行病學(xué)調(diào)查及其重組腺病毒疫苗實(shí)驗(yàn)免疫研究.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)已經(jīng)成為中國(guó)流行比較嚴(yán)重的豬病之一，特別是2006年爆發(fā)的高致病性PRRSV，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前國(guó)內(nèi)PRRSV流行毒株仍以美洲型為主，但在2011年以后隨著歐洲型毒株在國(guó)內(nèi)密集報(bào)道，證實(shí)國(guó)內(nèi)也存在歐洲型毒株流行。PCV2是無(wú)囊膜單鏈DNA病毒，可分為PCV2a、PCV2b、PCV2c和PCV2d四個(gè)亞型。PCV2是引起豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病的主要病原體，臨床上常見PRRSV和PCV2混合感

2、染，推測(cè)二者可能存在協(xié)同作用，導(dǎo)致豬死亡率增高。PRRSV和PCV2混合感染實(shí)驗(yàn)證實(shí)，PCV2復(fù)制增強(qiáng)可以導(dǎo)致PRRSV對(duì)肺組織損傷的嚴(yán)重性增強(qiáng)。
　　本研究首先對(duì)2015-2016年廣西豬場(chǎng)PRRSV和PCV2的流行情況進(jìn)行監(jiān)測(cè)，并分析其遺傳變異情況;然后利用腺病毒載體構(gòu)建PRRSV和PCV2重組腺病毒候選疫苗;最后，利用小鼠和豬體對(duì)重組候選疫苗進(jìn)行免疫評(píng)價(jià)。主要研究結(jié)果如下:
　　(1)對(duì)2015-2016年廣西地區(qū)PR

3、RSV和PCV2流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，2015年廣西部分地區(qū)PRRSV和PCV2血清陽(yáng)性率分別為63％-90％和85％-93％。對(duì)廣西玉林市2014年-2016年P(guān)RRSV和PCV2跟蹤調(diào)查發(fā)現(xiàn)連續(xù)三年的PRRSV抗體陽(yáng)性率出現(xiàn)持續(xù)性下降。豬群體免疫不均勻或者免疫效果不佳更容易造成病毒變異，給疾病的預(yù)防和凈化造成巨大的障礙。本研究發(fā)現(xiàn)7株P(guān)RRSV均屬于美洲型高致病性毒株，且屬于2個(gè)不同基因亞群。GXB11-2015分離株存在2處不連續(xù)15

4、0個(gè)核苷酸缺失，氨基酸缺失特征為1+20+29。獲得27株P(guān)CV2全基因組序列，分析表明PCV2d可能成為中國(guó)廣西豬場(chǎng)的優(yōu)勢(shì)毒株。重組分析發(fā)現(xiàn)3處基因重組現(xiàn)象，壓力選擇分析表明ORF2更容易受到陽(yáng)性篩選。
　　(2)本實(shí)驗(yàn)以美洲型經(jīng)典VR2332株和HP-PRRSV GD株的ORF3、ORF5基因，歐洲型代表株LV株ORF3、ORF5基因及PCV2 NM株ORF2基因?yàn)榛A(chǔ)，利用穿梭質(zhì)粒pacAd5 K-N pA，成功構(gòu)建美洲型重

5、組腺病毒rAd-NAORF3-ORF5、歐洲型PRRSV和美洲型PRRSV二價(jià)重組腺病毒rAd-EUORF3-ORF5-NAORF3-ORF5、美洲型PRRSV和PCV2二聯(lián)重組腺病毒rAd-ORF2-NAORF3-ORF5、歐洲型PRRSV和PCV2二聯(lián)重組腺病毒rAd-ORF2-EUORF3-ORF5以及含有IL18細(xì)胞因子的rAd-NAORF3-ORF5-IL18和rAd-EUORF3-ORF5-IL18，并對(duì)重組腺病毒進(jìn)行篩選鑒

6、定。
　　(3)小鼠免疫試驗(yàn)結(jié)果表明，ORF5和ORF3具有免疫協(xié)同作用，可以促進(jìn)機(jī)體細(xì)胞免疫水平和體液免疫水平。IL18作為細(xì)胞因子佐劑可以促進(jìn)腺病毒rAd-NA-ORF3-ORF5-IL18、rAd-EU-ORF3-ORF5-IL18、rAd-ORF2-IL18的免疫效果。PRRSV-PCV2二聯(lián)重組腺病毒疫苗rAd-ORF2-NA-ORF3-ORF5、rAd-ORF2-EU-ORF3-ORF5能刺激小鼠細(xì)胞Th1類和Th2類

7、細(xì)胞免疫反應(yīng)。
　　(4)豬體免疫試驗(yàn)結(jié)果表明，PRRSV-PCV2重組腺病毒疫苗能誘導(dǎo)豬體產(chǎn)生較好的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)。免疫第35天時(shí)rAd-EU-ORF3-ORF5-NA-ORF3-ORF5免疫組CD4+T淋巴細(xì)胞的水平顯著高于野毒組1.46倍(P＜0.05)。LV株病毒攻毒后，野毒免疫組血液中的病毒載量高于rAd-NA-ORF3-ORF5-EU-ORF3-ORF53.5倍(P＜0.05)。攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)表明，重組腺病毒疫苗能夠

8、提供有效的免疫保護(hù)，表明所構(gòu)建的重組疫苗在抵抗PRRSV和PCV2病毒感染方面具有很好的發(fā)展?jié)摿Α?br>　　綜上所述，我國(guó)的PRRSV和PCV2毒株不斷發(fā)生新的變化，PRRSV外來(lái)毒株的及PCV2基因型的漂變給疾病的預(yù)防和控制帶來(lái)巨大的挑戰(zhàn)。本研究豐富了當(dāng)前PRRSV及其PCV2分子流行病學(xué)資料;利用腺病毒載體構(gòu)建歐洲型、美洲型PRRSV及其PCV2重組候選疫苗能夠在小鼠和豬體免疫中誘導(dǎo)特異的體液和細(xì)胞免疫，攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)證明可以提高對(duì)