上海地區(qū)PCV2分子流行病學(xué)及PCV2感染豬肺泡巨噬細胞的磷酸化蛋白組學(xué)研究.pdf

1、豬圓環(huán)病毒2型(Porcine cirovirus type2, PCV2)是引起豬圓環(huán)病毒病(porcine circovirus diseases, PCVD)的主要病原，嚴重危害豬群健康的全球性重要的傳染病。近年來，國內(nèi)外有關(guān)PCV2感染報道日益增多，引起人們廣泛的關(guān)注。為了了解上海地區(qū)PCV2流行狀況，我們對PCV2開展了流行病學(xué)調(diào)查，并對PCV2進行了遺傳變異分析。我國大多數(shù)地區(qū)豬群中PCV2的感染十分普遍，PCV2可能是一種

2、豬場常在病原體，其中PCV2與其他病原體共感染現(xiàn)象非常嚴重。本實驗借助蛋白質(zhì)組學(xué)和磷酸化修飾手段先從體外實驗分析 PCV2感染豬肺泡巨噬細胞系(porcine alveolar macrophage, PAM)后細胞因子表達和蛋白質(zhì)組學(xué)變化，探討 PCV2感染誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的機理，具體研究內(nèi)容如下：
　　1. PCV2分子流行病學(xué)調(diào)查
　　2014年到2015年初期間，從上海浦東、閔行、嘉定、奉賢的所有規(guī)?；i場中的疑似PCV

3、D患病豬群和正常豬群中采集組織樣品，采用聚合酶鏈式反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction, PCR)方法，分別檢測PCV1、PCV2。結(jié)果表明，PCV2感染陽性率為64.20％，從陽性病料中測序鑒定到10條PCV2序列，對其ORF2基因進行測序及分子遺傳演化分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，上海地區(qū)發(fā)病豬群中PCV2d為優(yōu)勢流行基因型，在同一豬場中同時存在 PCV2d、PCV2b及PCV2e。表明PCV2不同基因型毒株在豬體內(nèi)存在序列漂

4、移現(xiàn)象。PCV2的 ORF2同源性分析表明，本研究中的10株P(guān)CV2毒株之間同源性為90.3%~99%；10株P(guān)CV2毒株與國內(nèi)毒株間同源性高達90.3%~99.3%，與國外毒株間同源性為90.0%~99.7%。表明國內(nèi)、外PCV2毒株序列沒有明顯的地域差異。
　　2. PCV2感染豬肺泡巨噬細胞的磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究
　　本文分別利用實時熒光定量PCR(real-time PCR, RT-PCR)和間接免疫熒光技術(shù)(ind

5、irect immunoinfluscent assay, IFA)檢測各個時間點PCV2的病毒滴度和不同細胞因子(IL-6、IL-8、IL-10、IL-1β)的mRNA表達水平，以此為依據(jù)，確定PCV2感染豬肺泡巨噬細胞(porcine alveolar macrophages, PAMs)的早期和晚期時間點，分別是24 h和60 h。利用同位素標記相對和絕對定量(isobaric tags for relative and abso

6、lute quantificationI, iTRAQ)定量組學(xué)的方法分別在PCV2感染后的24 h和60 h時研究磷酸化蛋白質(zhì)的變化。
　　本次研究中,我們鑒定了925獨特的磷酸化蛋白，24 h和60 h鑒定到692個和691個磷酸化蛋白，這些磷酸化蛋白的變化為探究PCV2免疫抑制和致病機制提供了大量信息。分析磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)，我們發(fā)現(xiàn)PCV2在感染宿主細胞時，抑制細胞凋亡，促進自噬，可能是由于Hippo和Notch信號通路