線粒體融合蛋白2和膠質(zhì)纖維酸性蛋白在脊髓損傷及體外培養(yǎng)星形膠質(zhì)細胞劃傷后表達.pdf

1、目的：通過檢測脊髓損傷及體外培養(yǎng)星形膠質(zhì)細胞劃傷后線粒體融合蛋白-2(mitofusions-2,Mfn2)和膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glialfibrillaryacidicprotein,GFAP)的表達變化,為下一階段進行Mfn2過表達抑制脊髓損傷(spinalcordinjury,SCI)后星形膠質(zhì)細胞活化的研究提供基礎。
　　方法：建立大鼠脊髓損傷模型和體外培養(yǎng)星形膠質(zhì)細胞劃傷模型,運用免疫熒光和WesternBlotting

2、方法,檢測Mfn2和GFAP表達變化。第一部分:清潔級成年雄性SD大鼠48只,隨機分為兩組:假手術組(sham組,n=24),脊髓損傷組(SCI組,n=24),SCI組采用Allen's法建立大鼠胸段脊髓損傷模型,假手術組只行椎板切除術,分別于術后第1天、第3天、第7天、第14天四個時間點分批處死大鼠,取大鼠胸段脊髓組織,行組織免疫熒光染色觀察脊髓形態(tài)變化,WesternBlotting檢測各個時間點Mfn2和GFAP的表達變化。第二部

3、分:原代培養(yǎng)純化的星形膠質(zhì)細胞傳代后種于直徑3.5cm的細胞培養(yǎng)皿,隨機分為對照組(n=6)、1小時組(n=6)、12小時組(n=6)、24小時組(n=6)、48小時組(n=6),待培養(yǎng)皿中星形膠質(zhì)細胞生長達80-90％融合度后,用無菌黃槍頭行“井”字形劃傷細胞,對照組不做任何處理,分別于劃傷后1小時、12小時、24小時、48小時四個時間點時,采用細胞免疫熒光染色觀察星形膠質(zhì)細胞(astrocyte,AS)形態(tài)變化,WesternBlo

4、tting檢測各個時間點Mfn2和GFAP的表達變化。
　　結果：①大鼠脊髓組織進行免疫熒光染色,正置熒光顯微鏡下觀察結果發(fā)現(xiàn):脊髓損傷后,大鼠胸段脊髓灰質(zhì)兩背角之間會形成結構紊亂、邊界不清的損傷灶;WesternBlotting結果顯示脊髓損傷后,大鼠胸段脊髓Mfn2蛋白表達從第1天開始下降,與sham組相比,脊髓損傷組胸段脊髓Mfn2表達整體呈下降趨勢,術后第3天開始明顯下降,差異有統(tǒng)計學意義(p<0.05),GFAP表達隨時

5、間延長則逐漸增加,術后第3天開始差異有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。②細胞免疫熒光結果發(fā)現(xiàn)劃傷后離體培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細胞反應性增生,細胞體積增大、突起增多,胞內(nèi)Mfn2表達下降;WesternBlotting結果發(fā)現(xiàn),與對照組相比,劃傷組星形膠質(zhì)細胞內(nèi)Mfn2表達整體也呈下降趨勢,第12小時開始出現(xiàn)明顯下降,差異有統(tǒng)計學意義(p<0.05),而GFAP表達整體呈上升趨勢,第24h時才開始出現(xiàn)明顯上升,差異有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。

6、>　　結論：①脊髓損傷及體外培養(yǎng)星形膠質(zhì)細胞劃傷后,星形膠質(zhì)細胞的特異性標志物GFAP表達整體呈上升趨勢,提示此時體內(nèi)及體外AS均出現(xiàn)大量增殖;與此相反,脊髓損傷及體外培養(yǎng)星形膠質(zhì)細胞劃傷后,Mfn2這種增殖抑制基因的表達產(chǎn)物Mfn2蛋白則表達減少?？梢?脊髓損傷及體外培養(yǎng)星形膠質(zhì)細胞劃傷后,星形膠質(zhì)細胞的增殖與活化程度與Mfn2的表達量呈現(xiàn)反比關系,提示脊髓中內(nèi)源性Mfn2表達減少可能在脊髓損傷后AS過度活化過程中扮演重要角色。②首次