和厚樸酚抑制線粒體可溶蛋白誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞活化的體外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：研究和厚樸酚對(duì)線粒體可溶蛋白誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞活化的抑制作用。
　　 方法：BV2小膠質(zhì)細(xì)胞復(fù)蘇后加入完全培養(yǎng)基(10％FBS-DMEM)，置于5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，隨機(jī)分為3組:(1)空白對(duì)照組(control):加無(wú)血清培養(yǎng)基;(2)線粒體可溶蛋白組(MDP):接種24h后行1μg/ml、10g/ml、100μg/ml濃度MDP按1、3、5、7h處理。(3)和厚樸酚干預(yù)組(HNK):和厚樸酚孵育30mi

2、n后行MDP處理，且和厚樸酚存在于MDP作用整個(gè)過(guò)程。ELISA分別檢測(cè)以0μg/ml、1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml濃度MDP刺激7h時(shí)的細(xì)胞上清液中白細(xì)胞介素IL-6和TNF-α含量;和以MDP為100μg/ml處理1、3、5、7h白細(xì)胞介素IL-6和TNF-α含量;根據(jù)前兩組結(jié)果，檢測(cè)HNK組與MDP組的白細(xì)胞介素IL-6和TNF-α含量;采用RT-PCR方法半定量測(cè)定空白對(duì)照組、MDP組與HNK組轉(zhuǎn)錄因子Klf4

3、的表達(dá)情況;倒置相差顯微鏡觀察各組細(xì)胞形態(tài)變化及免疫熒光染色顯示IBA1蛋白的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：1.ELISA結(jié)果:當(dāng)MPS濃度為1μg/ml處理7h時(shí)，與對(duì)照組比較細(xì)胞上清液中白細(xì)胞介素IL-6和TNF-α含量表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05);當(dāng)MPS濃度為10μg/ml或100μg/ml處理7h時(shí)，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)，提示小膠質(zhì)細(xì)胞激活呈現(xiàn)一定的濃度依賴(lài)性;當(dāng)MPS為100μg/ml時(shí)，在1、3、

4、5、7h各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞上清液中白細(xì)胞介素IL-6和TNF-α含量表達(dá)水平與空白對(duì)照組比較組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)，提示隨著刺激時(shí)間的延長(zhǎng)，小膠質(zhì)細(xì)胞活化程度增強(qiáng)，當(dāng)MPS為100μg/ml時(shí)處理7h時(shí)，檢測(cè)HNK組與MDP組的上清液中白細(xì)胞介素IL-6和TNF-α含量有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05)，提示和厚樸酚能夠抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，降低了炎性介質(zhì)的釋放。
　　 2.RT-PCR結(jié)果:MDP組與空白組和HNK組比較

5、組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明線粒體可溶蛋白刺激小膠質(zhì)細(xì)胞后Klf4明顯上調(diào)，而和厚樸酚能下調(diào)活化的小膠質(zhì)細(xì)胞Klf4表達(dá)。
　　 3.形態(tài)學(xué)觀察:倒置相差顯微鏡觀察到空白組細(xì)胞主要表現(xiàn)為胞體較小，突起呈分枝狀;MDP組明顯表現(xiàn)為小膠質(zhì)細(xì)胞的胞體變圓或者橢圓，突起消失，呈“阿米巴”狀。而HNK組活化狀態(tài)的小膠質(zhì)細(xì)胞明顯減少。熒光顯微鏡下觀察免疫熒光染色BV2小膠質(zhì)細(xì)胞在無(wú)MDP刺激的情況下，Ibal蛋白沒(méi)有表達(dá)。MDP組小膠質(zhì)細(xì)胞