人腦膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(GFAP)原核表達(dá)載體的構(gòu)建及蛋白表達(dá)的鑒定.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、背景：膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(GFAP)在神經(jīng)損傷的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用。 目的：對GFAP進(jìn)行基因克隆，構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒并加以鑒定。 設(shè)計(jì)、時間及地點(diǎn)：單一樣本研究，于2008-09/11上海市長征醫(yī)院神經(jīng)外科實(shí)驗(yàn)室完成。 材料：中間載體pGEM-T Easy質(zhì)粒購于Promega公司，原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-2由上海市長征醫(yī)院神經(jīng)外科實(shí)驗(yàn)室保存。 方法：從人腦膠質(zhì)瘤組織提取mRNA，采用RT-P

2、CR的方法擴(kuò)增GFAP序列并表達(dá)，然后與載體pGEX-4T-2連接，轉(zhuǎn)化宿主菌BL21構(gòu)建重組質(zhì)粒，誘導(dǎo)表達(dá)后純化，Western-blot鑒定。 主要觀察指標(biāo)：總RNA鑒定結(jié)果，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分子質(zhì)量的鑒定，重組表達(dá)載體的酶切鑒定，Western-blot鑒定。 結(jié)果：目的載體構(gòu)建完成后，用雙酶切、DNA測序與Western-blot的方法證實(shí)原核表達(dá)載體構(gòu)建成功。 結(jié)論：pGEX-4T-2-GFAP原核表達(dá)載

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