應用siRNA抑制星形細胞膠質纖維酸性蛋白基因后對GFAP表達的影響.pdf

1、本實驗旨在經體外分離、培養(yǎng)來純化獲得的星形膠質細胞，并導入以膠質纖維酸性蛋白基因的不同位點為靶標的3條siRNA誘導膠質纖維酸性蛋白mRNA基因沉默，通過觀察細胞形態(tài)變化及檢測細胞GFAP表達改變，來分析應用siRNA技術抑制靶基因后對相關蛋白表達的影響，以期為抑制脊髓損傷后星形膠質細胞過度活化，并為進一步研究解決SCI后瘢痕過度增生、清除脊髓軸突再生障礙，從而促進神經軸突損傷修復奠定實驗基礎。 研究方法：分離1周內新生SD大鼠

2、大腦皮層細胞，用含20﹪血清的DMEM/F12的培養(yǎng)基培養(yǎng)，經原代及傳代培養(yǎng)，并以GFAP-FITC免疫熒光法對所獲細胞進行鑒定。待傳代培養(yǎng)生長態(tài)勢良好時，隨機將其分為6組(空白對照、陽性對照、陰性對照、3種不同的siRNA各對應一組，分別為S1/S2/S3組)，進行特異性siRNA轉染，轉染后繼續(xù)培養(yǎng)24小時，并對細胞形態(tài)的變化進行觀察記錄、應用GFAP-FITC免疫熒光法對各組AS進行檢測；收集各組細胞應用Western-blott

3、ing檢測GFAP的表達。 研究結果：轉染后的細胞體積較空白組細胞體積減小，細胞突起減少或變短，增長趨勢在一定程度上被遏制；免疫熒光法顯示轉染組細胞內的GFAP熒光明顯較空白組減弱；Western-blotting檢測表明，轉染后24h星形膠質細胞的GFAP表達較空白對照組及陰性對照組明顯下調(P＜0.05)。 研究結論：體外分離培養(yǎng)可獲得純度較高的星形膠質纖維細胞；在應用siRNA轉染后，星形膠質纖維細胞的體積較轉染前