VEGF靶向性siRNA表達載體的構建及其沉寂作用.pdf

1、背景和目的 骨肉瘤是一種臨床常見的成骨性惡性腫瘤，約占所有骨腫瘤的20％。其惡性程度高，好發(fā)于青少年。由于80％的患者在就診時即已經發(fā)生轉移，20％-30％的患者無論采取何種治療，預后均極為不佳，近30年來，骨肉瘤的總體療效相對上世紀80年代并無很大的提高。如何進一步提高惡性骨腫瘤患者的療效和生存率，仍是臨床亟待解決的重要課題。 大量研究表明人類多種腫瘤細胞和體外培養(yǎng)的腫瘤細胞都可產生VEGF(vascularendot

2、hlialgrowthfactor，VEGF)，多種腫瘤組織VEGF表達也明顯高于其來源的正常組織，腫瘤組織VEGF表達水平與腫瘤血管化程度，惡性度呈正相關。血管內皮生長因子(VEGF)是一種重要的促血管形成因子，通過增加微血管的通透性和特異性的與血管內皮細胞受體結合，促進血管內皮細胞的分裂和增殖，進而導致新生血管的生成，具有促血管形成和增加血管通透性的雙重功能，在腫瘤的發(fā)展、轉移及預后等方面均起著重要的作用。 因此如何有效的抑

3、制VEGF的表達是腫瘤治療的關鍵所在。目前研究較多的有抗VEGF及VEGFR的單克隆抗體，反義寡核苷酸片段等，但效果不甚理想。近幾年來興起的RNA干擾技術，為腫瘤的分子生物治療開辟了新的途徑。與傳統基因沉默技術相比，具有效果強、持續(xù)時間長等優(yōu)勢，目前這一技術已在腫瘤的基因治療方面顯示出誘人的前景。為此本實驗設計并構建了針對VEGF的siRNA表達載體，轉染入人骨肉瘤細胞系MG-63觀察其對細胞VEGF表達的沉默效應。 方法

4、 依據GenBank中VEGF基因(BC065522)的序列，利用以下幾個網址提供的設計分析軟件進行設計http：//www.ambion.com/techlib/misc/siRNAdesign.html：http：//www2.takara-bio.co.jp/sirna-d/top.php。對上述候選siRNA序列通過美國生物技術信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)的在線

5、同源序列檢索http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast，確定針對VEGF的siRNA序列。合成VEGF發(fā)卡樣siRNA寡核苷酸，退火成雙鏈DNA，克隆入T載體，利用α互補和T7/SP6PCR擴增篩選鑒定重組子pGEM-T-VEGF；用BglⅡ和HindⅢ雙酶切重組子pGEM-T-VEGF和siRNA表達載體pSuperneo；將雙粘VEGF發(fā)卡樣siRNA片段亞克隆入siRNA表達載體pSuperneo中；利用B

6、glⅡ和HindⅢ雙酶切篩選鑒定重組子pSuperneo-VEGF；對插入序列進行DNA序列分析。將siRNA表達載體pSuperneo-VEGF轉入人骨肉瘤細胞系MG-63中，用RT-PCR方法檢測細胞VEGFmRNA表達水平。 結果 1.得到19個侯選VEGFsiRNA靶區(qū)段，對上述候選序列通過美國生物技術信息中心的在線同源序列檢索，最后確定的編碼序列是19個堿基，TCATCACGAAGTGGTGAAG(573-59

7、1nt)。 2.siRNA發(fā)卡DNA的退火后，電泳可見明亮條帶，位于約70bp處，與設計完全一致。 3.退火產物與pGEM-TEasy連接后，轉化JMl09，篩選鑒定后得到重組子pGEM-T-VEGF。 4.亞克隆后，用BglⅡ/HindⅢ雙酶切對重組質粒進行鑒定，得到pSuperneo-VEGF。 5.對重組子pSuperneo-VEGF插入片段DNA序列結果與設計完全一致。 6.轉染pSupe

8、rneo-VEGF的實驗組骨肉瘤細胞中VEGFmRNA表達幾乎完全被抑制，而兩個對照組(無關siRNA對照組和空載體對照組)和未轉染的骨肉瘤細胞系MG-63細胞中都存在較高水平的VEGFmRNA表達。 結論 1.設計出針對VEGF的發(fā)卡樣siRNA寡核苷酸片段。 2.成功構建出針對VEGF的siRNA表達載體pSuperneo-VEGF 3.pSuperneo-VEGF轉染骨肉瘤細胞后能顯著降低細胞VEG