靶向Pim-3的雙功能shRNA表達(dá)載體的構(gòu)建及其對(duì)小鼠肝癌的治療作用.pdf

1、目的：
　　 肝癌是我國(guó)最常見的惡性腫瘤之一，近年來(lái)隨著分子生物學(xué)等基礎(chǔ)研究向肝癌領(lǐng)域的滲透，許多學(xué)者開始從分子水平上研究肝癌的發(fā)生與發(fā)展，其中一些原癌基因的異常高表達(dá)得到了廣泛的關(guān)注。由此把基因治療和生物治療引入到肝癌治療中，RNAi(RNAinterference)技術(shù)就是研究得比較廣泛的一種。本課題選擇針對(duì)肝癌靶基因Pim-3進(jìn)行研究，是因?yàn)槟壳瓣P(guān)于它的研究主要集中在造血系統(tǒng)及消化系統(tǒng)的一些腫瘤，但有關(guān)Pim-3和肝癌的關(guān)

2、系報(bào)道并不多。另一方面，在腫瘤的發(fā)生過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞可以通過(guò)許多機(jī)制，比如增加IL-10或者TGF-β等免疫抑制性細(xì)胞因子的產(chǎn)生、促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的活化以及增殖等來(lái)抑制機(jī)體免疫應(yīng)答，從而使自身逃逸免疫系統(tǒng)的監(jiān)視，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。因此對(duì)于腫瘤的治療，通過(guò)一些免疫刺激劑比如某些RNA序列，來(lái)激活機(jī)體某些固有的模式識(shí)別受體，有望通過(guò)激活天然免疫應(yīng)答，來(lái)重新喚醒機(jī)體的整個(gè)免疫系統(tǒng)，進(jìn)而引起機(jī)體本身對(duì)于肝癌細(xì)胞的主動(dòng)殺傷和清除。基于上述背景

3、，我們?cè)O(shè)計(jì)并構(gòu)建這樣一種雙功能載體:既能夠表達(dá)靶向沉默Pim-3基因的shRNA，又能夠表達(dá)激活TLR受體的單鏈RNA。在體外觀察雙功能載體對(duì)Pim-3-的沉默作用和對(duì)肝癌細(xì)胞系凋亡、增殖等細(xì)胞生物學(xué)特性的影響，及其對(duì)于免疫系統(tǒng)的活化情況;同時(shí)以Hepa1-6細(xì)胞對(duì)C57BL/6小鼠進(jìn)行皮下荷瘤，在腫瘤形成后，瘤內(nèi)注射這種雙功能的表達(dá)載體，觀察其對(duì)于腫瘤的治療情況以及脾臟淋巴細(xì)胞的活化情況。
　　 方法：
　　 1.以小

4、鼠的肝癌細(xì)胞系Hepa1-6為主要研究對(duì)象，首先通過(guò)RT-PCR和Western-blot檢測(cè)Pim-3在兩種小鼠肝癌細(xì)胞系Hepa1-6和H22以及正常的小鼠胚胎肝細(xì)胞BNL.CL2中的表達(dá)。
　　 2.用雙功能載體轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞系Hepa1-6，通過(guò)PCR和Western-blot等方法檢測(cè)載體對(duì)Pim-3表達(dá)的沉默效果;檢測(cè)Hepa1-6細(xì)胞中TLR信號(hào)通路的活化情況，主要檢測(cè)Ⅰ型干擾素的分泌，以確定雙功能載體是否構(gòu)建成功。

5、
　　 3.用雙功能載體轉(zhuǎn)染Hepa1-624h后，利用流式細(xì)胞儀，通過(guò)AnnexinV/PI染色和TUNEL免疫熒光技術(shù)檢測(cè)肝癌細(xì)胞凋亡的變化。
　　 4.用雙功能載體轉(zhuǎn)染Hepa1-624h后，通過(guò)Western-blot等方法檢測(cè)Bad、p-Bad、BCL-2、BCL-XL等凋亡相關(guān)分子的表達(dá)以及凋亡信號(hào)通路中caspase-8的活化水平。
　　 5.用Hepa1-6對(duì)C57BL/6小鼠進(jìn)行皮下荷瘤，觀察瘤

6、內(nèi)注射雙功能載體后，小鼠腫瘤的生長(zhǎng)情況，以及脾臟不同淋巴細(xì)胞的比例和活化情況。
　　 6.進(jìn)一步研究雙功能載體治療后，脾臟中NK細(xì)胞對(duì)Hepa1-6的殺傷情況、NK細(xì)胞NK受體的表達(dá)情況、CD4+T細(xì)胞PD-1表達(dá)以及外周血TH1和TH2類細(xì)胞因子的分泌情況。
　　 7.用Hepa1-6對(duì)C57BL/6小鼠進(jìn)行皮下荷瘤，通過(guò)清除抗體分別對(duì)NK和CD4+T細(xì)胞進(jìn)行清除，觀察在雙功能載體介導(dǎo)的抗腫瘤作用中，這兩種細(xì)胞所起的作

7、用。
　　 8.體外觀察雙功能載體作用于Hepa1-6細(xì)胞后TLR7的表達(dá)情況和NF-κB信號(hào)通路的活化情況;通過(guò)TLR特異性功能抑制實(shí)驗(yàn)來(lái)確定TLR7在雙功能載體介導(dǎo)的腫瘤治療中所發(fā)揮的作用。
　　 結(jié)果：
　　 1.Pim-3在正常小鼠肝組織和正常肝細(xì)胞中表達(dá)極低，而在肝癌細(xì)胞系中明顯高表達(dá)。
　　 2.成功構(gòu)建既能沉默原癌基因Pim-3又能表達(dá)具有免疫刺激作用的ssRNA-shRNA雙功能載體。

8、r>　　 3.用雙功能載體轉(zhuǎn)染Hepa1-6細(xì)胞后，Hepa1-6細(xì)胞中的Pim-3在蛋白水平和基因水平上的表達(dá)均有明顯的下調(diào)，細(xì)胞凋亡明顯增加，凋亡相關(guān)分子p-Bad、BCL-2、BCL-xl的表達(dá)明顯下調(diào)，caspase-8的分泌明顯增加。
　　 4.用Hepa1-6細(xì)胞對(duì)C57BL/6小鼠進(jìn)行皮下荷瘤2周，隨后瘤內(nèi)注射雙功能載體進(jìn)行治療，發(fā)現(xiàn)雙功能載體可以顯著抑制腫瘤的生長(zhǎng)，同時(shí)增加脾臟淋巴細(xì)胞中NK細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞

9、的比例，并且誘導(dǎo)NK細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞的活化。
　　 5.進(jìn)一步分析脾臟NK細(xì)胞的殺傷活性發(fā)現(xiàn)，在用雙功能載體治療后的小鼠中，NK細(xì)胞表現(xiàn)出最強(qiáng)的殺傷活性，同時(shí)NK細(xì)胞NKG2D表達(dá)增強(qiáng)，NKG2A表達(dá)降低;IFN-γ表達(dá)增強(qiáng)，PD-1的表達(dá)降低，而CD4+T細(xì)胞所表達(dá)的PD-1也明顯降低，外周血中TH1細(xì)胞因子表達(dá)增加，而TH2細(xì)胞因子的表達(dá)減少。
　　 6.用Hepa1-6對(duì)C57BL/6和小鼠進(jìn)行皮下荷瘤，腫瘤形

10、成后，通過(guò)特異性抗體分別對(duì)NK或者CD4+T細(xì)胞進(jìn)行清除，發(fā)現(xiàn)清除NK細(xì)胞后雙功能載體的抗腫瘤作用明顯削弱。
　　 7.CD4+T細(xì)胞的存在對(duì)于維持NK細(xì)胞的活化起著重要的作用，在清除CD4+T細(xì)胞后，NK細(xì)胞的活化明顯減弱。
　　 8.在體外用雙功能載體轉(zhuǎn)染Hepa1-6細(xì)胞后，TLR7表達(dá)明顯上調(diào)，NF-κB的磷酸化水平升高;通過(guò)抑制劑阻斷小鼠體內(nèi)的TLR7后，雙功能載體的抗腫瘤活性減弱，NK和CD4+T細(xì)胞的活化都

11、受到了影響。
　　 結(jié)論：
　　 1.成功構(gòu)建了能夠特異性沉默Pim-3和表達(dá)免疫刺激性ssRNA的雙功能載體。
　　 2.雙功能表達(dá)載體能顯著抑制肝癌細(xì)胞中Pim-3的內(nèi)源性表達(dá)，進(jìn)而明顯誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞系Hepa1-6細(xì)胞的凋亡，并能誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素的基因表達(dá)和蛋白分泌。
　　 3.雙功能載體能抑制肝癌皮下荷瘤小鼠中腫瘤的生長(zhǎng)，并能引起脾臟和腫瘤原位淋巴細(xì)胞NK和CD4+T細(xì)胞的活化。
　　 4.在

12、雙功能載體介導(dǎo)的腫瘤治療作用中，NK細(xì)胞的功能是必不可少的。雙功能載體能增強(qiáng)NK細(xì)胞活化性受體NKG2D的表達(dá)，下調(diào)抑制性受體NKG2A的表達(dá)，且增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞表面NKG2D配體的表達(dá)，從而提高NK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的直接殺傷活性。
　　 5.雙功能載體能明顯誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞的活化，而且CD4+T細(xì)胞主要對(duì)NK細(xì)胞的活化起著輔助作用。
　　 6.在雙功能載體介導(dǎo)的腫瘤治療過(guò)程中，TLR7對(duì)ssRNA的識(shí)別及其信號(hào)通路的活化是