防治楊樹葉枯病的毒蘑菇菌株篩選及其生防機(jī)理研究.pdf

1、楊樹葉枯病是東北地區(qū)苗圃近年來較為流行的主要林木病害之一，由鏈格孢菌（Alternaria alternata）引起，對該病的防治側(cè)重于使用化學(xué)農(nóng)藥。殘留在土壤中的化學(xué)農(nóng)藥是農(nóng)業(yè)面源污染物的主要來源之一，而農(nóng)業(yè)面源污染是造成水體污染的重要原因。由于在防治該病的過程中，大量地使用化學(xué)農(nóng)藥，目前已造成了嚴(yán)重的環(huán)境污染與經(jīng)濟(jì)損失，尋求高效、安全、無污染的綠色生物農(nóng)藥更顯得尤為迫切。毒蘑菇所含有的多種活性物質(zhì)可抗菌、抗蟲、抗病毒等，在生物防治領(lǐng)

2、域顯示出了巨大的應(yīng)用開發(fā)潛力，因而以毒蘑菇為來源研究開發(fā)防治楊樹葉枯病的微生物農(nóng)藥，具有極其重要的意義。
　　從8個毒蘑菇菌株中，篩選到了對葉枯病菌（A.alternata）生長抑制能力最強(qiáng)的菌株為絨白乳菇（Lactarius vellereus），其培養(yǎng)液對該病原菌菌體生長的抑制率為61.44％，對其孢子萌發(fā)的抑制率為91.45%；絨白乳菇（L.vellereus）生長的最適pH為6～7，最適生長溫度為25℃；能較好地利用甘露醇

3、、琥珀酸、甘氨酸，煙酸有明顯的促生長作用。
　　研究了絨白乳菇（L.vellereus）抑菌活性物質(zhì)的提取工藝。結(jié)果表明，絨白乳菇（L.vellereus）抑菌活性物質(zhì)主要存在于發(fā)酵液中，最佳提取工藝為發(fā)酵液與正丁醇以13萃取3h，萃取1次，在此條件下得到的發(fā)酵液提取物對葉枯病菌（A.alternata）菌體生長的抑制率為78.95%，對其孢子萌發(fā)的抑制率為91.47%。
　　通過對發(fā)酵液提取物室內(nèi)防治效果，以及毒性的研究，

4、得出以下結(jié)論：該提取物能夠有效控制葉枯病斑的個數(shù)及病斑的擴(kuò)展速度，接菌后4h施藥與施藥后4h接菌的防效分別達(dá)到了88.99%和87.80%；對小白鼠進(jìn)行經(jīng)口灌胃染毒實(shí)驗，確定了發(fā)酵液提取物的半數(shù)致死量為8570.8mg/kg，為低毒，提取物對小白鼠無觸殺毒性，在楊樹葉片上無殘留毒性。
　　發(fā)酵液提取物在pH5～7、30～80℃的范圍內(nèi)抑菌活性穩(wěn)定；濃度為0.1%的H2O2與Na2SO3不影響提取物的抑菌活性；低濃度的Cu2+與Al

5、3+對提取物的抑菌活性破壞嚴(yán)重，高濃度的Fe3+、Fe2+與Zn2+對提取物的抑菌活性有破壞作用；紫外線與貯存時間對其抑菌活性無影響。
　　研究了發(fā)酵液提取物對葉枯病菌（A.alternata）的生物防治機(jī)理。結(jié)果表明，該提取物能夠抑制菌體4種保護(hù)酶的活性，使膜脂過氧化嚴(yán)重；該提取物能夠引起菌體ATP酶階段性的增強(qiáng)，使同一階段的HK、PK、LDH、SDH、MDH活力與輔酶Ⅰ含量下降，干擾了糖酵解與TCA循環(huán)的順利進(jìn)行，直接以菌體電

6、導(dǎo)率、呼吸強(qiáng)度、蛋白質(zhì)含量的下降及菌體與孢子形態(tài)發(fā)生非正常的變化表現(xiàn)出來，最終使菌體膜系統(tǒng)完整性喪失。
　　采用生物活性跟蹤技術(shù)，運(yùn)用柱層析、TLC等方法對發(fā)酵液提取物中的抑菌活性成分進(jìn)行了分離、純化，得到了能完全抑制葉枯病菌（A.alternata）生長的活性成分，純度為98.805%，綜合UV、IR、EI-MS、NMR的檢測結(jié)果，推斷此化合物的分子式是C8H9NO，分子量為135，化學(xué)名為1-(2-吡啶基)-2-丙酮，將其命名

7、為絨白乳菇素PP。
　　對絨白乳菇（L.vellereus）深層發(fā)酵生產(chǎn)1-(2-吡啶基)-2-丙酮的培養(yǎng)基配方進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方為（1000mL）：2g葡萄糖、50g麩皮、1.25g硫酸銨、1.25g黃豆粉、71.20mg無機(jī)鹽、120mg煙酸，在此條件下測得發(fā)酵液中1-(2-吡啶基)-2-丙酮的含量為12.69mg/L。
　　對絨白乳菇（L.vellereus）深層發(fā)酵生產(chǎn)1-(2-吡啶基)-2-丙