江蘇部分地區(qū)牛群腸出血性大腸桿菌分離株分子流行病學及EHEC O157：H7鞭毛蛋白單克隆抗體的研制.pdf

1、產志賀氏毒素大腸桿菌(shiga toxin-producing E. coli，STEC)是一群重要的腸道致病菌。目前至少有100多種血清型的大腸桿菌具有產志賀氏毒素的能力，其中血清型為0157：H7的菌株具較高致病力。通常將人類感染病例中分離的具有pO157質粒、產生AE損傷(attaching and effacing lesion)的STEC菌株統(tǒng)稱為腸出血性大腸桿菌(entero-hemorrhagic E. coli，EHE

2、C)。EHEC主要包括O157:H7，026:H11和O111等幾種血清型，其中O157:H7作為典型菌株，主要通過食物傳播，健康家畜，特別是反芻動物如牛、羊等被視作為該菌的天然帶菌動物。該類細菌能夠引起人類腹瀉，出血性結腸炎(haemorrhagic colitis，HC)，溶血性尿毒綜合征(haemolytic uraemic syndrome，HUS)，血栓性血小板減少性紫癜(thromboticthrombocytopenic

3、purpura，TTP)等，嚴重者可導致死亡。 鑒于EHEC對人類的高致病性，對該類細菌在自然界的流行特征、生物學特性、致病因子、感染機理及防治等各方面的深入研究顯得愈發(fā)重要?，F(xiàn)今，通過分子生物學、免疫學等手段實現(xiàn)EHEC的快速臨床檢測，是防止人類發(fā)生EHEC感染的重要途徑之一。通過對毒力因子的深入研究，將促進新的檢測、診斷方法的開發(fā)，為控制EHEC的流行提供有力手段；與此同時，將在進出口檢驗和公共衛(wèi)生方面具有一定的應用前景。

4、 1.EHEC多重PCR檢測方法的建立及其分子流行病學 本研究基于ElIEC O157:H7 EDL933W株的stx1、stx2、eaeA、hlyA四個基因建立了多重PCR檢測方法。并運用該多重PCR體系配合選擇性增菌、分離培養(yǎng)等-檢測手段，初步了解EHEC 0157、026、0111以及其他血清型的STEC大腸桿菌在牛群的帶菌和流行情況。研究期間共采集動物糞便等樣品共計1128份，最終獲得分離株共計74株，分離率為6.

5、56％。所獲得菌株的毒力相關基因的攜帶表現(xiàn)出一定的多態(tài)性，其中屬于STEC的為30株，占分離株總數(shù)的40.54％。經過血清學鑒定其中典型的EHEC血清型有026和0157，分離菌株數(shù)分別是23株和2株，各占已定型菌株的34.33％和2.99％，分別占采集樣品總數(shù)的2.04％和0.18％。結果表明，在牛群中非0157血清型的EHEC菌株如026等所占的比例更高。由此提示，牛糞可能是食品中EHEC污染的來源，因此控制大腸桿菌EHEC在牛場環(huán)

6、境中的存活與擴散，加強牛肉及其制品以及牛奶中該類細菌的檢測，是防止人類發(fā)生EHEC感染的重要途徑之一。 2. EItEC感染ICR小鼠動物模型的建立 本實驗通過萘啶酮酸(nalidixic acid，Nal)飲水、絲裂霉素(mitomycin，MMC)腹腔注射并結合小鼠體內傳代的方法初步建立了EHEC感染的ICR小鼠模型，復制出了人類感染EHEC所出現(xiàn)的部分臨床癥狀和主要病理變化。證實以109 CFU的EHEC灌服感染小

7、鼠，可致半數(shù)及以上的3周齡ICR小鼠死亡，確定了小鼠的感染劑量，并初步掌握了各受試分離株的致病力；同時，本實驗對感染小鼠的糞便排菌情況及細菌在各臟器的分布情況進行了分析，結果表明感染小鼠的排菌時間均在14 d以上，糞便中細菌平均含量達104 CFU/g以上；實驗組各受檢臟器的活菌分布基本一致，但以盲、結腸最多，可達107CFU/g以上。該動物模型的成功建立對探索此類細菌的感染機制、毒力因子的致病作用有重要意義，并為其疫苗侯選株安全性的評

8、價打下基礎。 3. EHEC 0157:H7鞭毛蛋白單克隆抗體的研制 本研究以EHEC 0157:H7的滅活全菌與粗提的鞭毛蛋白作為免疫原，利用細胞融合技術獲得了10株分泌抗EHEC 0157:H7單克隆抗體(monoclonal antibodies，MAbs)的雜交瘤細胞株，用間接ELISA法測定其免疫球蛋白亞類，并結合ELISA法、凝集法和’Westem blot鑒定單抗的特異性。結果顯示，其中6株僅與血清型為01

9、57的大腸桿菌參考株和分離株反應，與其他受試菌株均不反應。結合ELISA效價與直接凝集價，雜交瘤細胞株7E2、4E2、1D7的效價最高，特異性較強。由粗提鞭毛蛋白作為免疫原的1株單抗1A6僅與EHEC 0157:H7菌株及同樣表達H7鞭毛的026血清型的STEC H8反應，與血清型為0157的非EHEC E.coli不發(fā)生反應；經ELISA與Western blot鑒定該株的抗原結合位點是鞭毛蛋白抗原。鑒于該株單抗較高的特異性，在制備檢