動物源腸出血性大腸桿菌O157-H7分子流行病學分析.pdf

1、大腸桿菌O157：H7是一種重要的腸道致病菌，是腸出血性大腸桿菌(EnterohemorrhagicEscherichiacoli，EHEC)的一個主要菌型。近年來，屢屢在國內(nèi)肉制品中檢測到大腸桿菌O157感染。它可導致人急性食物中毒，是國家規(guī)定必檢的病原菌。該菌在世界各地都有不同規(guī)模的暴發(fā)流行，其感染具有潛在的暴發(fā)流行趨勢、強烈的致病性、致死性以及抗生素治療可能會加劇病情等特點，目前已成為全球性的公共衛(wèi)生問題，所以對該菌進行有效的防控

2、研究成為當前亟需解決的問題。為了更好掌握該菌在動物群體中的感染情況及其流行菌株的分子特征，為控制其在人畜中的流行提供參考依據(jù)，作者進行了以下研究。
　　 1.基于大腸桿菌O157：F17參考菌株的rfbE、fliC、eaeA三個基因建立三重PCR檢測方法，了解大腸桿菌O157：F17在本地區(qū)的流行情況。對三重PCR反應體系的退火溫度、退火時間、引物濃度、Mg2+濃度和PCR循環(huán)次數(shù)進行優(yōu)化，并對該方法的敏感性、特異性進行了評價。

3、用該方法對動物糞便樣品進行檢測，結果表明本方法具有極高的特異性，敏感性可達到103cfu/mL，并從臨床樣品中分離鑒定到大腸桿菌O157：F17菌株。本研究成功建立了大腸桿菌O157：H7三重PCR檢測方法，并可應用于臨床樣品檢測，為大腸桿菌O157：H7的分子流行病學調查提供了一種新的檢測方法。
　　 2.利用常規(guī)細菌分離鑒定方法對來自河南省各地市以及甘肅、廣西、四川等地的2067份樣品進行了大腸桿菌O157：F17的分離鑒定

4、。從這些糞樣中分離到6株O157：H7菌株，3株O157：H?菌株，并綜合血清學方法、生化反應、分子生物學方法對分離株進行了鑒定。由常規(guī)細菌分離方法分離到的大腸桿菌O157菌株與血清學方法、生化反應、PCR鑒定結果相一致，屬于大腸桿菌O157菌株。雖然從樣品中分離到的OI57菌株陽性率很低，而目前大腸桿菌O157也沒有出現(xiàn)大的爆發(fā)，但是在臨床樣品中畢竟有該菌的存在，說明目前該菌仍然存在潛在的暴發(fā)危險，仍然需要加強對該菌的監(jiān)控和預警。

5、r>　　 3.為了更好地了解大腸桿菌O157各分離株之間的系統(tǒng)發(fā)育關系，并進一步確定大腸桿菌O157分離株的進化地位及其溯源。本研究以大腸桿菌O157：H7分離株利O157：H?分離株為研究對象，根據(jù)GenBank上登錄的相關序列，針對大腸桿菌的三個管家基因16SrRNA、gyrB、recA以及兩個志賀毒素基因stx1、stx2設計引物，進行PCR擴增、克隆、序列測定，并且通過構建進化樹來進行系統(tǒng)演化分析。結果表明，大腸桿菌O157分

6、離株與陽性參考菌株在基于三個管家基因所建立的進化樹上種系發(fā)育關系非常接近；對毒力基因分析發(fā)現(xiàn)，2株O157：H?菌株不含stx2基因，1株O157：H?菌株不含stx基因；通過進化樹進行溯源分析，可推測出各分離株的大致起源，本研究為大腸桿菌O157分子流行病學研究和快速溯源提供了參考。
　　 4.根據(jù)Genbank公布的大腸桿菌O157：H7rfbE和fliC基因序列設計兩對引物，并對熒光定量PCR反應條件進行優(yōu)化，建立檢測大腸

7、桿菌O157：H7的雙重實時熒光定量PCR反應體系，并對該方法的特異性、敏感性和重復性進行了評價。應用該二重實時熒光定量PCR對所有大腸桿菌O157：H7菌株的檢測結果均為陽性，對沙門菌、志賀菌、枸櫞酸桿菌、巴氏桿菌、腸球菌、鏈球菌1型、鏈球菌2型等菌株則為陰性；該方法檢測的靈敏度可達2.95×100copies/μL，比普通PCR的靈敏度高103倍；定量檢測的批內(nèi)與批間變異系數(shù)均小于2％；本研究建立的熒光定量PCR方法為大腸桿菌O15

8、7：H7的臨床診斷，以及食品安全檢測提供了新的鑒定方法，同時也為食源性疾病的分子流行病學調查提供新的檢測手段。
　　 5.應用多位點可變數(shù)量串聯(lián)重復序列分析技術(MLVA)對大腸桿菌O157：H7進行了分子流行病學分析，初步研究了大腸桿菌O157：H7分離株的基因型，并對MINA分型方法進行了評價。本研究采用核酸提取、PCR和瓊脂糖凝膠電泳等技術，結合BioNumerics(Version5.0)軟件，利用上述方法對O157：H