版權說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權,請進行舉報或認領
文檔簡介
1、腸出血性大腸桿菌(EHEC)O157∶H7是一種重要的新發(fā)人畜共患傳染病病原菌。自1975年被首次分離、1982年被確認為致病菌以來的近30年中,世界各地包括中國都有不同規(guī)模的暴發(fā)流行。EHECO157∶H7感染可使人患腹瀉、出血性結腸炎(hemorrhagiccolitis,HC),還可在5~10%的病例中引發(fā)溶血性尿毒綜合癥(hemolyticuremicsyndrome,HUS)及血栓性血小板減少紫癜(thromboticthro
2、mbocytopenicpurpura,TTP)等嚴重并發(fā)癥,嚴重者可導致死亡。EHECO157∶H7的感染因具有暴發(fā)流行趨勢、強烈的致病性與致死性和抗生素治療可加劇病情的危險性等特點,已經(jīng)成為全球性的公共衛(wèi)生問題。我國已將腸出血性大腸桿菌列為21世紀可能對國人衛(wèi)生健康有重大影響的12種病原微生物之一。同時,O157∶H7菌培養(yǎng)容易、繁殖迅速、感染力強、感染途徑廣泛,使之極有可能作為未來軍事斗爭中的細菌戰(zhàn)劑和生物恐怖戰(zhàn)劑。美國疾病預防控
3、制中心(CDC)已將EHECO157∶H7菌列為B類生物恐怖病原體嚴加防范。 目前,EHECO157∶H7的全基因組測序已經(jīng)完成,但對其感染仍缺乏有效的治療方法。臨床上針對O157∶H7菌的感染主要采用抗生素治療及相應的對癥治療。新近的研究發(fā)現(xiàn),抗生素使菌體破裂,導致O157∶H7菌志賀樣毒素(Shigaliketoxin,Stx)的釋放水平大大提高,使得抗生素對病程無明顯影響甚至導致病程的延長,從而增加發(fā)生并發(fā)癥的危險并引起死
4、亡。人類同感染性疾病作斗爭的歷史證明,抗體是治療某些感染性疾病的首選方法。由于O157∶H7菌的感染易引起暴發(fā)流行,且對其感染尚缺乏有效的治療方法,治療性抗體的研究就顯得尤為緊迫。 EHECO157∶H7主要產(chǎn)生兩種毒素,分別稱為志賀樣毒素Ⅰ(Stx1)和志賀樣毒素Ⅱ(Stx2)。在細菌體內(nèi),Stx2為分泌型表達,Stx1為胞內(nèi)表達。兩種毒素均由1個A亞單位和5個B亞單位組成,A亞單位具有細胞內(nèi)毒性,能與28SrRNA作用從而抑
5、制蛋白質(zhì)合成,是大腸桿菌O157∶H7引起臨床表現(xiàn)的病理基礎;B亞單位具有細胞結合特性,能與具有特定糖鞘脂受體(Gb3)的細胞結合,從而引導A亞單位發(fā)揮作用,是志賀樣毒素致病的關鍵。多數(shù)O157∶H7細菌產(chǎn)生Stx2,而且Stx2毒性強于Stx1,與HUS及TTP等嚴重并發(fā)癥的相關性更為密切。因此Stx2是該菌致病性的重要物質(zhì)基礎,是理想的制備中和毒素的特異性抗體的靶抗原。 EHECO157∶H7感染致病的機理主要包括兩個方面,
6、即在腸道的定植以及產(chǎn)生毒素Stx,Stx可以進入血液循環(huán),引起靶組織器官,如腎小球和結腸內(nèi)皮細胞的損傷。Stx與其糖鞘脂受體Gb3的特異性結合決定了該毒素的致病性,因此特異性阻止Stx和Gb3受體結合的能中和Stx的抗體可以防止進一步引起病理變化。 基于以上認識,本研究從以下幾個方面進行治療性抗腸出血性大腸桿菌O157∶H7志賀樣毒素Ⅱ基因工程抗體的實驗研究。 1.O157∶H7全毒素及其亞單位抗原的獲得 方法;
7、按Genbank公布的Stx2核酸序列,根據(jù)引物設計原則設計了三對引物,以Stx2cDNA為模板,選擇合適的PCR反應條件進行擴增。T-A克隆后構建原核表達質(zhì)粒,經(jīng)測序鑒定后轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3),IPTG誘導表達。經(jīng)鎳離子親和層析聯(lián)合分子篩純化目的蛋白Stx2A及Stx2B,并經(jīng)SDS-PAGE、Westernblot、免疫家兔等鑒定重組蛋白的純度和免疫學活性。通過對HeLa細胞的細胞毒作用及對Balb/c小鼠攻毒實驗,鑒
8、定重組蛋白Stx2的生物學活性。結果PCR法自O157∶H7菌基因組分別擴增得到stx2(約1240bp)、stx2a(約890bp)及stx2b(約210bp)的基因片段,片段大小與預期相符。原核表達質(zhì)粒pET11c-stx2、pET11c-stx2a、pET22b(+)-stx2b經(jīng)酶切及測序鑒定與GenBank公布的序列完全一致。轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)后,經(jīng)IPTG誘導,Stx2、Stx2A及Stx2B蛋白的表達率分別
9、為25%、30%、30%。破菌后SDS-PAGE證實,Stx2A蛋白以包涵體形式表達,Stx2B蛋白以可溶形式表達。純化后的Stx2A及Stx2B蛋白,純度>85%。Stx2A及Stx2B免疫家兔獲得了較高效價的多抗血清,雙擴效價分別為1∶16和1∶8。重組蛋白Stx2主要以包涵體形式表達,亦有可溶形式表達??扇苄问奖磉_的Stx2具有與Gb3結合活性,CD50約為35pg,對小鼠的LD100為0.010mg;O157∶H7菌超聲破菌上清
10、中的Stx2毒素對HeLa細胞的CD50約為50pg,對小鼠的LD100約為0.050mg,結果表明,在總蛋白濃度相同的條件下,重組工程菌pET11c-stx2/BL21超聲破菌上清中的Stx2毒素含量高于野生型O157∶H7菌株的Stx2含量,差異極顯著,p<0.01。結論重組蛋白Stx2A及Stx2B具有免疫學活性,可以替代野生型O157∶H7分泌的天然毒素Stx2蛋白,以用作抗原制備抗Stx2的新型的基因工程抗體。可溶形式表達的重
11、組蛋白Stx2具有生物學活性,可用于O157∶H7感染的基礎與臨床研究。 2.鼠抗Stx2亞單位單克隆抗體的制備及生物學功能研究 方法;單克隆抗體的制備參照傳統(tǒng)雜交瘤技術方法進行,將小鼠骨髓瘤細胞SP2/0與Stx2A(Stx2B-BSA)免疫的Balb/c小鼠的脾臟B淋巴細胞在聚乙二醇(PEG)作用下進行細胞融合,ELISA法篩選出穩(wěn)定分泌抗Stx2A(Stx2B)單克隆抗體的雜交瘤細胞株。將雜交瘤細胞注入小鼠腹腔誘生
12、腹水以獲得大量單克隆抗體。采用親和層析法(蛋白A-Sepharose)純化腹水IgG,并對其類和亞類及輕鏈型進行鑒定。SDS-PAGE鑒定IgG純度,ELISA法檢測腹水效價,間接ELISA法測定抗體的親和常數(shù),Westernblot鑒定單克隆抗體特異性及其作用抗原的分子量,通過非標記ELISA相加試驗分析單抗所識別的抗原表位。通過檢測抗體體外抑制Stx2對HeLa細胞的細胞毒作用和在小鼠體內(nèi)中和毒素的實驗鑒定抗體的生物學功能。結果獲得
13、2株能穩(wěn)定分泌抗Stx2A抗體的單克隆雜交瘤細胞株,5F3和5C11;2株能穩(wěn)定分泌抗Stx2B抗體的單克隆雜交瘤細胞株1A4和1A5。將4株細胞分別注入小鼠腹腔,均成功誘生大量腹水。腹水IgG抗體經(jīng)親和層析法純化后純度均達85%以上。雜交瘤單克隆細胞株5F3、5C11、1A4和1A5分泌的單克隆抗體分別屬于IgG1、IgG2a、IgG1和IgG1,輕鏈均為κ型;親和常數(shù)Ka分別為1.7×109、6.3×108、5.7×107和1.9×
14、107。Westernblot結果表明,單抗5F3、5C11、1A4和1A5均能與野生型O157∶H7超聲破菌上清中的天然Stx2毒素蛋白特異結合。4株單抗在體外均能中和野生型O157∶H7菌超聲上清中的Stx2毒素,從而抑制Stx2對HeLa細胞的細胞毒作用,與無關抗體1D6比較,差異極顯著,p<0.01;同等劑量的抗體,抑制Stx2對HeLa細胞的細胞毒作用的抑制率不同, 5F3>5C11>1A4>1A5,差異極顯著,p<0
15、.01;50%抑制率時4株單抗的劑量約為0.1~0.25μg。在動物體內(nèi),4株單抗均具有一定的中和活性,對Stx2毒素致死小鼠產(chǎn)生免疫性保護,與1D6對照組比較,小鼠的存活率差異極顯著,p<0.01;同等劑量的抗體,對Stx2毒素致死小鼠的免疫保護作用不同,5F3>5C11>1A4>1A5,小鼠的存活率差異極顯著,p<0.01;0.15mg的抗Stx2A抗體5F3在小鼠體內(nèi)能中和致死劑量的毒素,對Stx2毒素致死小鼠的免疫保護達80%。
16、 結論;4株抗Stx2單抗均具有一定的中和活性,中和活性最強的抗Stx2A單抗5F3可用于構建抗Stx2A單鏈抗體。 3.抗Stx2A單鏈抗體的構建及基因結構分析 方法;從雜交瘤細胞5F3中提取總RNA,以oligo(dT)15為隨機引物,RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA,然后采用通用的兼并性引物分別擴增抗體輕、重鏈可變區(qū)基因。將抗體輕、重鏈可變區(qū)基因用一編碼(Gly4Ser)3短肽的DNA片段連接成5’VH-Li
17、nker-VL3’片段,PCR擴增該片段。純化后的scFv片段與經(jīng)改造的載體pCANTAB6his相連,轉(zhuǎn)化E.coliTG1。對抗體基因進行測序,采用生物信息學方法對所得序列與現(xiàn)有已報道的其它各種抗體基因進行同源性比較,并分析其胚系基因來源。對由DNA序列推導的氨基酸序列進行分析并通過分子建模分析其二級結構。 4.抗Stx2A單鏈抗體在體外、體內(nèi)中和Stx2的實驗研究 方法;重組子轉(zhuǎn)入E.coliHB2151,構建重組
18、工程菌。經(jīng)IPTG誘導,收集誘導前后的培養(yǎng)上清液、重組工程菌及超聲破菌上清液與沉淀。超聲上清液和培養(yǎng)上清液經(jīng)鎳離子親和層析純化scFv。經(jīng)SDS-PAGE、Westemblot等鑒定scFv抗體的純度和特異性。通過檢測抗體體外抑制Stx2對HeLa細胞的細胞毒作用和在小鼠體內(nèi)中和毒素的活性鑒定抗體的生物學功能。 綜上所述,,本課題的實施作為本室O157∶H7感染治療性抗體研究的起步,希望能為這個意義重大的研究課題奠定一定的基礎。
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會有圖紙預覽,若沒有圖紙預覽就沒有圖紙。
- 4. 未經(jīng)權益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負責。
- 6. 下載文件中如有侵權或不適當內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準確性、安全性和完整性, 同時也不承擔用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- 腸出血性大腸桿菌O157:H7志賀樣毒素2B亞基的表達.pdf
- 腸出血性大腸桿菌(EHEC)O157:H7多價基因工程疫苗的實驗研究.pdf
- 腸出血性大腸桿菌O157:H7(EHEC O157:H7)基因工程多亞單位融合蛋白疫苗的實驗研究.pdf
- 腸出血性大腸桿菌O157:H7(EHEC O157:H7)基因工程雙亞單位融合蛋白疫苗的實驗研究.pdf
- 腸出血性大腸桿菌O157:H7植物疫苗的研究.pdf
- 一株弱毒的腸出血性大腸桿菌(EHEC)O157:H7的鑒定.pdf
- 商丘市出血性大腸桿菌O157:H7監(jiān)測和基因特征研究.pdf
- 腸出血性大腸桿菌O157:H7的PCR與免疫學檢測技術的研究.pdf
- 腸出血性大腸桿菌O157∶H7緊密素克隆表達及其免疫原性分析.pdf
- 腸出血性大腸桿菌O157:H7 EspA蛋白的重組表達及生物學作用研究.pdf
- 出血性大腸桿菌O157:H7 OI28島的致病作用研究.pdf
- 腸出血性大腸桿菌O157:H7 TccP蛋白表達、純化及多克隆抗體的制備和應用研究.pdf
- 腸出血性大腸桿菌(EHEC)O157:H7 tccP基因缺失菌株的構建及其生物學性狀的研究.pdf
- 腸出血性大腸桿菌O157-H7 EspN蛋白功能初探.pdf
- 腸出血性大腸桿菌
- 腸出血性大腸桿菌O157:H7新型融合蛋白免疫原性分析及動物保護效果評價.pdf
- 腸出血性大腸桿菌(EHEC)O157:H7 EspA B細胞表位的鑒定及免疫學性質(zhì)研究.pdf
- 基于腸出血性大腸桿菌EHEC O157:H7 EspA的高效融合表達載體的設計、構建及應用研究.pdf
- 腸出血性大腸桿菌EHECO157-H7的分子進化研究.pdf
- 腸出血性大腸桿菌O157-H7z3672基因的敲除與毒力評價.pdf
評論
0/150
提交評論