腸出血性大腸桿菌O157-H7 EspN蛋白功能初探.pdf

1、腸出血性大腸桿菌（EnterohaemorrhagicEscherichia coli, EHEC）是具有一般大腸桿菌形態(tài)特征、革蘭氏陰性、無芽孢的直桿菌。EHEC是動物傳染性腸道病原，在世界范圍造成散發(fā)。EHEC定植于腸道，產(chǎn)生志賀毒素，造成腹瀉，并可引發(fā)出血性結(jié)腸炎及出血性尿毒綜合癥，兒童和老人最易感。自美國1982年首次爆發(fā)并確定為病原以來，世界上許多國家均相繼發(fā)生過EHEC感染的流行，現(xiàn)今其感染已成為一個(gè)全球性的公共衛(wèi)生問題。目

2、前仍無有效治療 EHEC感染的方法。因?yàn)榭股刂委煏蟠笤黾尤苎阅蚨揪C合征的發(fā)病率，國家衛(wèi)生部禁止使用抗生素對EHEC感染或疑似感染患者進(jìn)行治療。深入理解 EHEC致病機(jī)理可為預(yù)防和治療EHEC感染提供線索。
　　EHEC進(jìn)入腸道后，粘附于派伊爾氏結(jié)（Peyer's patch）處的濾泡相關(guān)上皮細(xì)胞和回腸末端腸絨毛。EHEC可被腸道 M細(xì)胞攝入，并轉(zhuǎn)移給腸道巨噬細(xì)胞。EHEC可在巨噬細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，并合成大量志賀毒素。釋放的志賀毒素

3、具有細(xì)胞毒性、腸毒性和神經(jīng)毒性。EHEC還利用III型分泌系統(tǒng)將細(xì)菌編碼的效應(yīng)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到真核細(xì)胞中，通過III型分泌系統(tǒng)進(jìn)入到宿主細(xì)胞中的效應(yīng)蛋白能夠通過非常精細(xì)的調(diào)控，來操縱細(xì)胞內(nèi)的生物學(xué)過程，從而有效的逃逸宿主細(xì)胞的防御反應(yīng)。
　　由此可見，EHEC致病過程中，志賀毒素和經(jīng)III型分泌系統(tǒng)進(jìn)入宿主細(xì)胞的效應(yīng)蛋白發(fā)揮著重要作用。對經(jīng)III型分泌系統(tǒng)進(jìn)入宿主細(xì)胞發(fā)揮作用的EHEC效應(yīng)蛋白的研究將有助于揭示 EHEC的致病機(jī)理。To

4、ru等人利用生物信息學(xué)方法預(yù)測了一系列潛在的經(jīng)III型分泌系統(tǒng)進(jìn)入宿主細(xì)胞的效應(yīng)蛋白，分別命名為EspK、EspL、EspM、EspN、EspO、EspR等。這些預(yù)測方法缺乏確鑿的證據(jù)，我們首要的工作是通過實(shí)驗(yàn)方法確認(rèn) EspN是 III型分泌系統(tǒng)的效應(yīng)因子，進(jìn)一步探討EspN在EHEC感染損傷中是否行使功能。
　　一、在細(xì)菌感染時(shí)EspN通過III型分泌系統(tǒng)進(jìn)入宿主細(xì)胞
　　本實(shí)驗(yàn)利用PCR技術(shù)從EHEC O157:H7E

5、DL933全基因組中擴(kuò)增了espN基因，將其擴(kuò)增到 TEM基因上游，構(gòu)建成融合質(zhì)粒 espN-TEM-pET-28a，利用電穿孔技術(shù)分別將其轉(zhuǎn)入EHEC O157:H7 EDL933野生株（wild type，WT）和三型分泌系統(tǒng)缺失株中（ΔescN::EHEC），構(gòu)建了espN-TEM/WT和espN-TEM/ΔescN，在系統(tǒng)中選擇已知的EHEC三型分泌系統(tǒng)效應(yīng)蛋白Map作為考察 TEM報(bào)告系統(tǒng)的陽性對照。結(jié)果證實(shí)了在WT株中 Es

6、pN蛋白同Map蛋白都通過III分泌系統(tǒng)進(jìn)入細(xì)胞，伴隨目的基因進(jìn)入宿主細(xì)胞的TEM基因表達(dá)產(chǎn)物切割了CCF2-AM底物,由原本發(fā)射綠色熒光改為發(fā)射藍(lán)色熒光；在ΔescN株中EspN蛋白與Map蛋白都不能通過三型分泌系統(tǒng)進(jìn)入宿主細(xì)胞，Merge后的圖片CCF2-AM本身激發(fā)的綠色熒光占主導(dǎo)，這表明了espN基因編碼的EspN蛋白能夠通過EHEC的三型分泌系統(tǒng)進(jìn)入宿主細(xì)胞。
　　二、EspN蛋白參與EHEC的感染損傷
　　為了進(jìn)

7、一步探討EHEC O157：H7效應(yīng)蛋白EspN的功能和致病機(jī)制，利用λRed重組法構(gòu)建了espN基因缺失株ΔespN::EHEC（以下簡稱ΔespN）。在LB培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)ΔespN與WT，發(fā)現(xiàn)兩者在LB培養(yǎng)基中的生長速度無明顯變化，這表明缺失espN基因不影響EHEC自身的生長特性。在ΔespN菌株的基礎(chǔ)上轉(zhuǎn)入espN-pACYC184質(zhì)粒，構(gòu)建了缺失株的回補(bǔ)株ΔespN/espN。接著以HT-29細(xì)胞為模型，MOI=1：100感

8、染細(xì)胞2、4、6h，利用平板計(jì)數(shù)法測定粘附到細(xì)胞上的菌落數(shù)量，發(fā)現(xiàn)隨著感染時(shí)間增加各組細(xì)菌粘附在細(xì)胞上的數(shù)量都遞增，但是ΔespN與WT相比在各個(gè)感染時(shí)間點(diǎn)均無顯著差異，這表明EspN效應(yīng)蛋白不影響細(xì)胞的粘附作用。為了進(jìn)一步在體內(nèi)水平確定EspN效應(yīng)蛋白不影響細(xì)胞的粘附作用，我們在菌株感染小鼠后，檢測菌株在結(jié)腸中的定殖量以及在糞便中的排菌量，結(jié)果顯示，ΔespN在結(jié)腸中的定殖量與糞便中的排菌量都與 WT和ΔespN/espN無異，進(jìn)一步

9、說明了EspN效應(yīng)蛋白不影響細(xì)胞的粘附作用。
　　用前述三種菌株分別感染小鼠后，ΔespN感染導(dǎo)致小鼠致死率較WT感染下降了50％，較ΔespN/espN感染下降了30%，這表明缺失espN基因后對小鼠具有保護(hù)作用，而在espN基因存在的情況下有利于EHEC感染損傷小鼠。缺失株和回補(bǔ)株在小鼠致死率上有顯著差異，我們進(jìn)一步考察缺失espN基因后在感染小鼠過程中對小鼠器官的損傷是否存在差異，我們選取了 EHEC常見的損傷器官結(jié)腸和腎臟

10、，制備成組織縱切片以觀察腎臟和結(jié)腸病變情況，結(jié)果顯示在結(jié)腸組織中野生株感染造成的損傷較突變株嚴(yán)重（P=0.016），在腎臟組織中野生株感染造成的損傷較突變株嚴(yán)重（P=0.003）。
　　用前述三種菌株分別感染小鼠后，通過 ELISA檢測血清和結(jié)腸組織液中相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)所有細(xì)胞因子在小鼠血清中的表達(dá)量均高于結(jié)腸組織液中的表達(dá)量，其中在血清中檢測到細(xì)胞因子 IL-1β和志賀毒素在 WT和ΔespN/espN感染后的表達(dá)量顯著

11、高于ΔespN感染后的表達(dá)量（P＜0.01）。
　　三、EspN效應(yīng)蛋白與巨噬細(xì)胞的相互作用
　　利用WT、ΔespN、ΔespN/espN分別感染巨噬細(xì)胞THP-1后，檢測培養(yǎng)上清中IL-1β表達(dá)量，細(xì)胞裂解液中志賀毒素表達(dá)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)PMA刺激后的THP-1經(jīng) WT株感染后比ΔespN株感染后表達(dá)更高水平的IL-1β和志賀毒素，回補(bǔ)espN基因后 IL-1β和志賀毒素的表達(dá)又恢復(fù)到 WT株水平。上述三種菌株分別感染經(jīng)PM

12、A刺激后的THP-1細(xì)胞2h，加入慶大霉素處死胞外細(xì)菌，換入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)分別培養(yǎng)2h、24h，比較在2h時(shí)不同菌株感染的巨噬細(xì)胞包吞EHEC的能力，以及在24h時(shí)EHEC在巨噬細(xì)胞內(nèi)存活和增殖情況。結(jié)果顯示，WT株感染的巨噬細(xì)胞包吞 EHEC的能力顯著高于ΔespN(P＜0.0001)，ΔespN/espN株感染的巨噬細(xì)胞包吞EHEC的能力顯著高于ΔespN(P＜0.0001)。繼續(xù)培養(yǎng)在24h時(shí)，WT、ΔespN、ΔespN/esp

13、N在巨噬細(xì)胞內(nèi)的存活和增殖相比2h時(shí)無顯著性差異(P＞0.05，24h vs2h)。
　　綜合全文得出結(jié)論：經(jīng)過T3SS分泌系統(tǒng)進(jìn)入真核細(xì)胞的EspN效應(yīng)蛋白是non-LEE毒力島上基因編碼的效應(yīng)因子，不同于大多數(shù) LEE毒力島上的效應(yīng)因子，EspN不影響細(xì)菌的粘附作用，缺失espN基因后的菌株與WT相比在粘附能力上不存在差別。細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，EspN蛋白可以活化巨噬細(xì)胞THP-1高表達(dá)IL-1β，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞包吞EHEC